Tính trung bình mẫu và sai số chuẩn ít nhất 3 lần lặp lại của hoạt tính endo-β-1,4-glucanase bằng chương trình Microsoft Excel.
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Xác định chủng T. asperellum sinh endo-β-1,4-glucanase ngoại bàomạnh mạnh
Chủng nấm T. asperellum có hoạt độ enzyme glucanase mạnh được xác định thông qua vòng phân giải sau 24 giờ ủ dịch enzyme thô với đĩa thạch chứa 0,5% CMC ở 50oC.
Hình 3.1. Vòng phân giải CMC của 4 chủng nấm T. asperellum
CH2
CH2 SH16
PQ34
ĐC
Hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của 4 chủng nấm T. asperellum được trình bày trong bảng 3.1. Kết quả cho thấy cả 4 chủng đều có khả năng sinh tổng hợp enzyme. Trong đó, chủng PQ34 có khả năng thủy phân CMC cao nhất (dựa vào đường kính DVPG = 14 mm và độ sáng của vòng phân giải CMC) (Hình 3.1).
Bảng 3.1. Khả năng thủy phân CMC của các chủng T. asperellum
Chủng T. asperellum Đường kính vòng phân giải CMC (mm)
CH2 7,67 ± 0,76
SH16 11,33 ± 1,53
PQ34 14,00 ± 1,33
TN42 8,57 ± 0,658
3.2. Xác định hoạt độ endo-β-1,4-glucanase
Hoạt độ endo-β-1,4-glucanase của 4 chủng T. asperellum được trình bày trong bảng 3.2. Số liệu ở bảng này cho thấy chủng PQ34 có hoạt độ chung cao nhất (11,05 U/mL), và thấp nhất là chủng CH2 (0,62 U/mL).
Kết hợp số liệu ở hai bảng 3.1 và 3.2 có thể thấy hoạt độ của endo-β-1,4- glucanase của các chủng nấm T. asperellum tỷ lệ thuận với đường kính vòng phân giải. Từ đây, chúng tôi chọn chủng nấm T. asperellum PQ34 để tiế hành phân lập và tạo dòng gen mã hóa cho enzyme endo-β-1,4-glucanase.
Chủng T. asperellum Hoạt độ chung (U/mL)
CH2 0,62 ± 0,30
SH16 8,13 ± 0,52
PQ34 11,05 ± 0,44
TN42 5,79 ± 1,10
3.3. Xác định khối lượng phân tử của endo-β-1,4-glucanase
Xác định được khối lượng phân tử của endo-β-1,4-glucanase sẽ làm cơ sở cho việc thiết kế mồi đặc hiệu để khuếch đại gen mã hóa cho enzyme này.
Hình 3.2. Điện di SDS (A) và điện di cơ chất (B). M: thang chuẩn khối lượng phân tử protein.
Chúng tôi đã tiến hành điện di cơ chất dịch chiết enzyme và nhuộm bằng dung dịch Lugol để phát hiện các băng có hoạt tính endo-β-1,4-
glucanase. Sau khi nhuộm, dung dịch Lugol bắt màu với CMC trên gel polyacrylamide. Ở những băng có hoạt tính endo-β-1,4-glucanase, CMC bị thủy phân tạo nên một vệt sáng trong suốt.
Kết quả điện di cơ chất được trình bày ở hình 3.2 cho thấy cả 4 chủng nấm T. asperellum đều xuất hiện băng tương ứng với vị trí khoảng 45 kDa. Khi nuôi các chủng T. asperellum trong môi trường có bổ sung CMC, chúng đã tiết ra endo-β-1,4-glucanase phân hủy cơ chất này làm nguồn carbon để cung cấp dinh dưỡng cho cơ thể.
3.4. Khuếch đại gen mã hóa endo-β-1,4-glucanase
Phản ứng PCR được thực hiện với DNA khuôn mẫu của chủng nấm T.
asperellum PQ34 và cặp mồi EGF và EGR đặc hiệu cho gen endo-β-1,4- glucanase. Sản phẩm điện di trên gel được trình bày ở hình 3.3.
Hình 3.3. (A) Điện di DNA tổng số của chủng T. asperellum PQ34; (B) Sản phẩm PCR với cặp mồi EGF và EGR (B). MA: thang DNA chuẩn (lambda/HindIII); MB: thang DNA chuẩn (lambda/EcoRI+HindIII); 1A: DNA tổng số; 1B: sản phẩm PCR.
Hình 3.3A cho thấy DNA tổng số của chủng PQ34 được tách chiết tương đối sạch, không bị gãy và nồng độ đủ cho các nghiên cứu tiếp theo. Sản phẩm PCR thu được có kích thước khoảng 1250 bp (Hình 3.3B) tương đương với kích thước của gen endo-β-1,4-glucanase dùng để thiết kế mồi.