Chủng tảo Dunaliella sử dụng trong nghiên cứu được thu thập và phân lập từ các ruộng muối của 2 xã Ninh Thủy và Ninh Diêm.
Quy trình phân lập
Lấy mẫu tảo ở các ruộng muối bậc 1,2,3, các kênh dẫn nước,kênh xả nước Kiểm tra các điều kiện( nhiệt độ, pH, độ mặn)
Lọc mẫu (lọc qua bơng lọc, ly tâm mẫu…)
Quan sát sự cĩ mặt của tảo Dunaliella trong các mẫu bằng kính hiển vi
Nuơi bằng cách bổ sung mơi trường Johnson 8,8% NaCl vào mẫu Soi mẫu
Tiến hành phân lập mẫu
Phân lập được chủng tảo Dunaliella thuần
Phân lập
Thu mẫu, phân lập vi tảo Dunaliella sp. cĩ trên các ruộng muối bằng
- Phương pháp pha lỗng mẫu - Phương pháp cấy trên đĩa thạch
Sử dụng mơi trường trường Jonhson 8,8% NaCl
Thiết kế thí nghiệm
Thiết kế các điều kiện thí nghiệm để nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố mơi trường đến quá trình tăng tổng hợp β-
caroten: - Nhiệt độ - Cường độ ánh sáng - Độ mặn Xác định hàm lượng β- caroten
Đo hàm lượng β-caroten
Xử lý số
28
Thu mẫu: là bước đầu tiên trong quá trình nghiên cứu bất kì vi sinh vật nào. Mẫu được thu từ các ruộng muối và các kênh dẫn, xả nước của các xã Ninh Thủy, Ninh Diêm, mẫu được đựng trong các chai nhựa sạch đã chuẩn bị trước. Mẫu tảo sau khi thu, tiến hành kiểm tra các điều kiện như pH, độ mặn,cường độ ánh sáng nơi thu mẫu. Ta sử dụng một số dụng cụ để kiểm tra các thơng số trên như sau:
- Sử dụng nhiệt kế thủy ngân chia vạch (0–100oC) để xác định chính xác nhiệt độ của mơi trường nơi thu mẫu.
- Sử dụng giấy đo pH để đo pH của địa điểm thu mẫu.
- Sử dụng khúc xạ kế để đo độ mặn của nguồn nước. Do mơi trường cĩ độ mặn tương đối cao nên cần phải pha lỗng mẫu nước khoảng 10 lần trước khi đo, sau đĩ nhỏ 1-2 giọt nước trong mẫu nước cần xác định độ mặn lên mặt kính, rồi đưa kính ra nơi sáng quan sát và kết quả được hiển thị qua ống nhịm ngay sau đĩ.
- Sử dụng máy đo cường độ quang xác định cường độ ánh sáng. Đưa bộ phận cảm ứng ánh sáng ra nơi cần đo cường độ ánh sáng. Thơng số cường độ ánh sáng sẽ hiển thị trên màn hình.
Tăng sinh: Các mẫu sau khi được lấy về sẽ được lọc bằng lưới lọc sinh vật. Làm các tiêu bản giọt ép để quan sát sự cĩ mặt củatảo Dunaliella. Các mẫu cĩ sựu hiện diện của Dunaliella sẽ được làm giàu bằng cách bổ sung vào mơi trường Johnson 8,8% và bắt đầu sục khí ngay để các tế bào tảo Dunaliela phát triển. Sau một thời gian, khi thấy dung dịch dần cĩ màu xanh đặc trưng của tảo thì ta lại làm tiêu bản giọt ép và quan sát mẫu 1 lần nữa trước khi đem mẫu đi phân lập. Mẫu tảo được đem đi phân lập bằng 2 phương pháp đĩ là sử dụng phương pháp pha lỗng mẫu và phương pháp nuơi cấy trên đĩa thạch.
Dựa vào hình thái, màu sắc để chọn mẫu tảo mong muốn. Quá trình phân lập được lặp lại nhiều lần cho đến khi xác định được lồi thuần khiết
29
dựa vào quan sát trên kính hiển vi và một số tính chất khác. Sau đĩ được cấy chuyền vào các bình thủy tinh kích thước lớn để thu được một dịng tảo thuần.
Phân lập tảoDunaliella
Năm 2007 trường đại học Murdoch đã đưa ra 3 phương pháp phân lập giống tảo: phương pháp pha lỗng, phương pháp nuơi cấy trên mơi trường thạch, phương pháp nhặt tế bào bằng micropipette. Ở Việt Nam theo TS Hồng Thị Bích Mai thì ngồi 3 phương pháp trên thì bà cịn đề cập tới phương pháp lọc bằng các màng lọc với kích cỡ khác lỗ màng nhau [9].
a. Phương pháp pha lỗng mẫu
- Chuẩn bị các ống nghiệm sạch cĩ dung tích bằng nhau được khử trùng và đậy kín bằng nút bơng bên trên được bọc bằng giấy bạc, mỗi ống nghiệm cĩ chứa 9ml mơi trường Jonhson 8,8% NaCl và cĩ dán nhẵn ghi hệ số pha lỗng.
- Dùng pipet cĩ dung tích 1ml, hút 1ml dung dịch tảo mẫu ngồi tự nhiên đã nhân sinh khối đưa sang ống nghiêm đầu tiên cĩ hệ số pha lỗng là 10-1 và dùng pipet hút lên xả xống nhiều lần để trộn đều mẫu.
- Sau đĩ lấy 1ml từ ống nghiệm 10-1 đưa sang ống nghiệm 10-2 và làm tương tự như ống nghiệm 1. Cứ làm lần lượt như thế với các ống nghiệm tiếp theo ta lần lượt được các ống mẫu với các hệ số pha lỗng là 10-3,10-4,10-5,10-6,10-7.
30
Hình 2.2 Phân lập tảo Dunaliella bằng phương pháp pha lỗng mẫu
b, Phương pháp nuơi cấy trên đĩa thạch
- Mơi trường thạch là mơi trường Johnson 8,8% NaCl cĩ bổ sung 2% agar sau đĩ được đun sơi cho tan hết agar.
- Đổ thạch vào các đĩa pettri khoảng 10-15ml/đĩa sau đĩ mở nắp để nguội tự nhiên.
- Đậy nắp đĩa thạch lại sau đĩ khử trùng bằng đèn UV trong tủ cấy vơ trùng khoảng 10 phút các đĩa thạch sau khi được đổ.
- Dùng pipet 1ml hút đúng 1ml mẫu tảo cho vào các đĩa thạch rồi sau đĩ sử dụng que cấy chang để chang mẫu sao cho thật đều trên các đĩa thạch
- Sau thời gian là 2-3 tuần tiến hành quan sát các khuẩn lạc màu xanh, sau đĩ soi dưới kính hiển vi để xác định chính xác khuẩn lạc của tảo
Dunaliella. Sử dụng que cấy trịn lấy khuẩn lạc Dunaliella và đưa vào các ống nghiệm cĩ chứa mơi trường nuơi để nuơi tăng sinh.
- Lặp lại các thao tác thí nghiệm tới khi thu được khuẩn lạc thuần.