3. Nội dung nghiên cứu
2.2.2. Phƣơng pháp xác định trình tự nucleotide và xử lý số liệu
Các mẫu plasmid mang cDNA DEF1 đƣợc sử dụng để giải trình tự trên máy xác định trình tự nucleotit tự động ABI PRISM®
3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems – Mỹ).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Chƣơng 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU N
3.1. DEFENSIN 1
Hạt đậu xanh VN6, VN7, VN16 đƣợc xử lý bởi abscisic acid (ABA) để cảm ứng hoạt động gen defensin 1 (DEF1)
3 ng
. Quy trình tách RNA tổng số đƣợc thực hiện với Trizol reagents (Invitrogen).
Không giống DNA, RNA là loại phân tử không bền, dễ bị thủy phân bởi các ribonuclease (RNase). Hơn nữa các RNase lại có mặt ở khắp nơi, hoạt tính mạnh và rất bền, vì thế việc tách chiết RNase đòi hỏi thao tác thật cẩn thận để tránh mọi tạp nhiễm chứa RNase từ môi trƣờng, tất cả các dụng cụ phải đƣợc xử lý trƣớc khi tiến hành thí nghiệm.
Trong quá trình tách chiết, việc nghiền mẫu trong nitơ lỏng để phá vỡ thành tế bào và giải phóng các thành phần trong tế bào đòi hỏi thao tác phải nhanh. Các thành phần bổ sung nhƣ phenol, chloroform:isoamyl nhanh chóng biến tính protein, polysaccharide có trong hỗn hợp, giúp tách pha tốt sau quá trình ly tâm. Sản phẩm RNA tổng số đƣợc hòa tan trong nƣớc 0,1 % DEPC có tác dụng ngăn cản quá trình RNase thủy phân RNA.
Từ RNA tổng số, bằng phản ứng phiên mã ngƣợc đã tạo đƣợc cDNA để tiến hành phản ứng RT-PCR nhân gen DEF1.
RT-PCR, trong quá trình thực hiện, chúng tôi đã tính toán nhiệt độ gắn mồi và tiến hành phản ứng RT-
PCR. phản ứng RT-PCR xảy ra tối ƣu trong điều
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ nhân gen đƣợc kiểm tra trên gel agarose 1% cùng với thang DNA 1kb
ƣợc thể hiện ở hình 3.1. 0,25 kb 0,22 kb 1 2 3 M 3.1. cDNA DEF1 3 VN6, VN7, VN16 nghiên cứu
1- VN6; 2- VN7; 3- VN16; M: DNA Marker 1kb Plus (Fermentas)
Qua hình 3.1 cho thấy, ở 3 mẫu nghiên cứu VN6, VN7, VN16 xuất hiện băng DNA sáng rõ duy nhất có kích thƣớc khoảng 0,22 kb, độ dài của đoạn DNA vừa nhân đƣợc phù hợp với lý thuyết khi thiết kế mồi
d DEF1
AY437639 trên .
3.2. H
cDNA DEF 1
3.2.1. cDNA DEF1 6
Ngoài đoạn gen mong muốn, sản phẩm PCR còn có sản phẩm phụ, các nucleotide dƣ thừa sau phản ứng, mồi, enzyme… Vì vậy, để quá trình biến nạp đạt hiệu quả cao nhất, chúng tôi đã tiến hành tinh sạch (thôi gel) sản
phẩm PCR 6 theo bộ kit AccuPrep PCR
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ biến nạp. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR đƣợc
.
Sản phẩm PCR nhân cDNA sau khi đƣợc tinh sạch bằng kit đƣợc gắn vào vector tách dòng pBT nhờ enzyme nối T4 ligase để tạo vector tái tổ hợp. Phản ứng ghép nối dựa trên nguyên tắc bổ sung giữa hai đầu nucleotide A thò ra ở sản phẩm PCR với Taq - polymerase và hai đầu nucleotide T trên vector tách dòng pBT. Hỗn hợp đƣợc ủ ở 22o
C trong 1 giờ cho phản ứng xảy ra hoàn toàn, sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến chủng E.coli DH5α và đƣợc cấy trải trên môi trƣờng LB đặc (pepton, cao nấm men, NaCl, agarose) có bổ sung kháng sinh carbenicillin (100mg/l), X-gal (40mg/l) và IPTG (100µM). Ủ đĩa ở 37oC trong 16 giờ. Các khuẩn lạc xanh và khuẩn lạc trắng mọc đƣợc trên môi trƣờng chứng tỏ chúng đều mang vector pBT. Khuẩn lạc xanh là các khuẩn lạc mang pBT tự đóng vòng nên vẫn còn khả năng sinh tổng hợp protein β-galactosidase để phân giải cơ chất X-gal từ không màu thành màu xanh. Còn các khuẩn lạc màu trắng do mang vector pBT đã gián đoạn gen lac Z nên không thể phân giải cơ chất thành màu xanh, đây chính là dòng khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp.
Chọn khuẩn lạc màu trắng đem kiểm tra phản ứng colony- PCR với cặp mồi DEF1-F/VrDEF1-R.
- 3.2).
-
a cDNA.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
0,22 kb 0,25 kb
M 1 2 3 4
Hình 3.2. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm colony - PCR
M: DNA Marker 1kb Plus (Fermentas); Giếng 1, 2, 3, 4 dòng khuẩn lạc
3.2.2. DEF1
Trình tự nucleotide của cDNA DEF1 đã tách dòng đƣợc xác định trên thiết bị giải trình tự nucleotide tự động, ABI PRISM® 3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems). đƣợc phân tích
Bioedit BLAST trong NCBI
cDNA DEF1 của đậu xanh là 222 nucleotide. cDNA DEF1
6 với trình tự nucleotide của gen
DEF1 ở đậu xanh đã công bố trên đƣợc ở hình 3.3.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
3.3. S cDNA DEF1
gen
AY437639)
hình 3.3 cho thấy kích thƣớc cDNA DEF1 của giống đậu xanh VN6 và trình tự mang mã số AY437639 đều là 222 bp. Khi so sánh trình tự cDNA DEF1 của giống đậu xanh VN6 bằng BLAST trong ngân hàng gen Quốc tế, kết quả cho thấy cDNA DEF1 của giống VN6 và AY437639 giống nhau 97,7% . Nhƣ vậy, chúng tôi đã khuếch đại, tách dòng thành công và xác định đƣợc trình tự nucleotide của cDNA DEF1 từ giống đậu xanh VN6.
So sánh trình tự nucleotide của cDNA DEF1 phân lập từ giống đậu xanh VN6 xác định đƣợc có 5 vị trí nucleotide sai khác so với trình tự gen
DEF1 của mẫu đậu xanh 437639
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Bảng 3.1. Sự sai khác về trình tự nucleotide của cDNA DEF1 của giống đậu xanh VN6 và các trình tự có mã số AY437639 trên ngân hàng gen Quốc tế
Vị trí
Mẫu 12 41 60 87 112
AY437639 A T G T G
VN6 G C T C C
Bảng 3.1 cho thấy, tại vị trí nucleotide 12 (cDNA DEF1 phân lập từ giống đậu xanh VN6 là G còn gen DEF1 công bố trên ngân hàng gen Quốc tế mã số AY437639 là A), trình tự cDNA DEF1 phân lập từ giống đậu xanh VN6 là C còn gen DEF1 có mã số AY437639 là T ở vị trí 41), vị trí nucleotide 60 (cDNA DEF1 phân lập VN6 là T còn gen DEF1 phân lập trên ngân hàng gen Quốc tế mã số AY437639 là G), vị trí nucleotide 87 (cDNA
DEF1 VN6 là C còn gen DEF1 với mã số AY437639 là T), trình tự cDNA
DEF1 phân lập từ giống đậu xanh VN6 còn có một nucleotide sai khác với trình tự gen DEF1 công bố trên ngân hàng gen Quốc tế có mã số AY437639 tại vị trí nucleotide 112 (cDNA DEF1 VN6 là C còn gen DEF1 trên ngân hàng gen Quốc tế có mã số AY437639 là G)
Khi phân tích , ngoài trình tự nucleotide ngƣời ta còn quan tâm đến trình tự amino acid suy diễn, vì phân tử protein là sản phẩm của gen. Trên cơ sở đó, chúng tôi sử dụng phần mềm BioEdit để tiến hành so sánh trình tự amino acid suy diễn từ cDNA DEF1 của giống đậu xanh VN6 với AY437639 trên ngân hàng gen Quốc tế, kết quả đƣợc trình bày ở hình 3.4.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
DEF1
h VN6 với trình tự mang mã số AY437639 trên ngân hàng gen Quốc tế
3.4 cho thấy, trình tự amino acid suy diễn trong protein
DEF1 73 amino acid
97,3%. Tuy nhiên, hai trình tự này có sự khác nhau ở một vài vị trí amino
acid, :
3.2).
Bảng 3.2. Sự sai khác về trình tự amino acid suy diễn của protein DEF1 ở giống đậu xanh VN6 và trình tự mang mã số AY437639 trên ngân hàng
gen Quốc tế
Vị trí
Mẫu 14 38
AY437639 L (Leucine) G (Glycine)
VN6 P (Proline) R (Arginine)
Kết quả bảng 3.2 cho thấy, trình tự amino acid ở vị trí 14 (L) của giống đậu xanh có mã số AY437639 đƣợc thay bằng (P) giống đậu xanh VN6; ở vị trí 38, trình tự amino acid của giống đậu xanh mang mã số AY437639 là (G) đƣợc thay bằng (R) của giống đậu xanh VN6.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
3.3. PHÂN TÍCH SỰ ĐA DẠNG VỀ TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE VÀ TRÌNH TỰ AMINO ACID SUY DIỄN CỦA GEN DEF 1