3. Nội dung nghiên cứu
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phƣơng pháp sinh học phân tử
2.2.1.1. Phương pháp tách RNA tổng số
Hạt đậu xanh đƣợc xử lý bởi abscisic acid (ABA) để cảm ứng hoạt động của gen defensin 1 (DEF1) theo phƣơng pháp của Wang và cs (2002). ABA pha trong ethanol với nồng độ 1g/1ml, sau đó pha loãng ABA 1 - 3%, ngâm hạt trong 6h – 8h rồi rửa sạch bằng nƣớc. Ngâm hạt vào nƣớc ấm 40o
C, gieo hạt trên khay cát đƣợc 5 - 7 ngày tuổi lấy lá để tách RNA tổng số. Quy trình tách RNA tổng số đƣợc thực hiện với Trizol reagents (Invitrogen). Các dụng cụ sử dụng trong tách RNA đều đƣợc khử DEPC 0,01%.
(1) Nghiền mẫu trong nitơ lỏng bằng chày cối đã khử trùng.
(2) Bổ sung 1ml Trizol reagents, đảo đều, nhẹ nhàng trong 5 phút.
(3) Bổ sung 500µl chloroform:isoamyl (tỉ lệ 24:1) trong nhiệt độ phòng 5 phút.
(4) Ly tâm 8000v/p trong 15 phút ở 40oC.
(5) Lấy 600µl dịch nổi sang eppendolf mới loại 1,5ml.
(6) Bổ sung 300µl (isopropanol) + 50µl CH3COONa (3M) đảo nhẹ để 15 phút. (7) Ly tâm 8000vòng/phút trong 20 phút ở 40 oC.
(8) Loại bỏ dịch nổi, thu tủa.
(9) Rửa RNA bằng cồn 70% (đã pha trong DEPC 0,01%). (10) Ly tâm 10000vòng/phút trong 10 phút. Lặp lại 2 lần. (11) Làm khô 5 phút.
(12) Pha loãng RNA trong 40µl nƣớc khử DEPC 0,01%, ủ trong đá, sau đó ủ ở nhiệt độ 37oC để RNA tan hết.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ (13) Mẫu RNA thu đƣợc bảo quản trong tủ -84 oC.
2.2.1.2. Phương pháp tổng hợp cDNA từ mRNA
Tổng hợp cDNA đƣợc tiến hành theo quy trình bằng bộ kit RevertAid First Strand cDNA Synthesis (Thermo Scientific):
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA
H2O (DEPC) 5 µl
Mồi OligoT 1 µl
RNA khuôn 6 µl
Đảo đều nhẹ nhàng, ủ ở 65OC trong 5 phút. Sau đó để vào đá. Bổ sung:
5X Reaction Buffer 4 µl
RiboLock RNase Inhibitor (20 u/µl) 1 µl
dNTP 10mM 2 µl
RevertAid H Minus Reverse Transcriptase (200
u/µl) 1 µl
Tổng 20 µl
Ủ 25o
C trong 5 phút, 42oC trong 60 phút, 70oC trong 5 phút, bƣớc cuối ủ ở 4oC.
2.2.1.3. Kiểm tra RNA tổng số
.
Điện di kiểm tra RNA của các mẫu thí nghiệm trên gel agarose 1%. Sản phẩm điện di đƣợc nhuộm bằng ethidium bromide. Dựa vào hình ảnh điện di nồng độ và độ tinh sạch của RNA trong mẫu thí nghiệm đã tách
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ chiết.
.
2.2.1.4. Phương pháp nhân gen bằng kỹ thuật RT-PCR
PCR nhân gen: sau khi tổng hợp cDNA, thực hiện nhân gen DEF1 với
cặp mồi đặc hiệu 2.3.
Bảng 2.3. ặp mồi nhân gen DEF1
Mồi Trình tự mồi (5’-3’) Nhiệt độ
gắn mồi
VrDEF1-F CAC CAT GGC GCC GTC TCG ACG 58oC VrDEF1-R CTA GCA GAT CTT CTT GCA GAA GC 58oC
Thành phần phản ứng PCR nhân gen DEF1 ở đậu xanh đƣợc trình bày ở bảng 2.4. Bảng 2.4. Thành phần phản ứng nhân gen STT Thành phần Thể tích (μl) 1 PCR Master Mix 12 µl 2 cDNA 1 µl 3 Mồi VrDEF1-F (10pM/µl) 1 µl 4 Mồi VrDEF1-R (10pM/µl) 1 µl 5 H2O 10 µl Tổng 25 µl
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
- PCR với chu kỳ nhiệt 2.1.
2.1.
Sau khi thu đƣợc sản phẩm nhân gen, chúng tôi tiến hành kiểm tra sản phẩm nhân gen trên gel agarose 1%, nhuộm bản gel trong
ethidium bromide, soi và chụp ảnh.
2.2.1.5. Làm sạch sản phẩm PCR
Quá trình làm sạch sản phẩm PCR phục vụ việc tạo dòng đƣợc thực hiện với bộ kit AccuPrep PCR Purification Kit:
(1) Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1%, nhuộm và soi. (2) Cắt lấy băng quan tâm (chứa đoạn gel có kích thƣớc yêu cầu).
(3) Bổ sung đệm hòa tan (GB – Gel binding buffer) theo tỷ lệ Vmẫu : VGB = 1 : 5 (quy ƣớc 1μl tƣơng đƣơng 1mg mẫu).
(4) Ủ ở 60oC trong 10 phút, khoảng 2-3 phút lắc nhẹ một lần, sau khi gel tan hết thì ủ thêm 5 phút để gel tan hoàn toàn.
(5) Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột tinh sạch, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột.
∞ 3 phút 30 giây 94oC 94oC 30 giây 10 phút 72oC 72oC 30 giây 58oC 4oC 35 chu kỳ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ (6) Bổ sung 500μl đệm GB vào cột, để ở nhiệt độ phòng trong 2 phút. Sau đó đem ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột. Bƣớc này nhằm loại bỏ hoàn toàn những thành phần gel agarose còn sót lại.
(7) Rửa màng lọc chứa DNA bằng cách thêm 500μl đệm rửa WB (Washing buffer) lên cột. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột. Ly tâm lần hai để đảm bảo loại bỏ hết dịch WB.
(8) Chuyển cột sang ống eppendorf mới, bổ sung 30μl dung lịch đệm EL (Elution buffer) lên màng lọc, để ở nhiệt độ phòng trong 1 phút, sau đó đem ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ cột, thu dịch chứa mẫu DNA đã tinh sạch chuyển sang ống mới. Bảo quản ở -20o
C. (9) Điện di kiểm tra sản phẩm làm sạch gen DEF1.
2.2.1.6. Phương pháp tách dòng gen và xác định trình tự gen
phƣơng pháp của Sambrook và cs (2001).
Tạo plasmid tái tổ hợp
Sản phẩm PCR đƣợc gắn với vector pBT 2.2), thành phần phản ứng ở bảng 2.5.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng gắn gen vào vector
STT Thành phần Thể tích 1 Buffer T4 ligase 10X 1,0 μl 2 DNA 5,0 μl 3 Vector pBT (150ng/µl) 1,0 μl 4 T4 ligase 1,0 μl 5 H2O 2,0 μl Tổng 10 μl
Hỗn hợp đƣợc ủ ở nhiệt độ 22oC trong 3 giờ, sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α.
Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến chủng E. coli
Sau khi thực hiện phản ứng nối gen quan tâm và vector pBT, tiến hành biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E. coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt. Quy trình thực hiện nhƣ sau:
(1) Tế bào khả biến đƣợc lấy từ tủ -80oC và đƣợc để trong đá 10 phút.
(2) Lấy 5μl sản phẩm nối cho vào ống tế bào khả biến, đảo nhẹ. Để hỗn hợp trong đá 30 phút.
(3) Sốc nhiệt ở 42oC trong 90 giây, sau đó để ngay vào đá trong 10 phút. (4) Bổ sung 300μl LB lỏng (pepton, cao nấm men, NaCl) để nuôi phục hồi trong 1 giờ ở 37oC, lắc 200 vòng/phút.
(5) Cấy trải trên môi trƣờng LB đặc (pepton, cao nấm men, NaCl và agar) có bổ sung carbenicillin, IPTG và X-gal.
(6) Ủ đĩa ở 37oC trong 16 giờ.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Lấy dịch nuôi chứa khuẩn kiểm tra sản phẩm chọn dòng bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu. Phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu đƣợc thực hiện tƣơng tự nhƣ phản ứng PCR nhân gen DEF1, nhƣng DNA tổng số thay bằng DNA plasmid (2 µl). Sản phẩm PCR chọn dòng đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% trong đệm TAE 1X. Sau đó nhuộm gel trong ethidium bromide và chụp ảnh dƣới ánh sáng đèn cực tím.
Tách plasmid tái tổ hợp
Sau khi nuôi cấy tế bào đã đƣợc biến nạp trên môi trƣờng LB lỏng có bổ sung carbenicillin, tiến hành tách chiết plasmid theo quy trình sau:
(1) Ly tâm dịch vi khuẩn 7000 vòng/phút trong 5 phút, 4oC. Loại bỏ dịch nổi, thu cặn.
(2) Bổ sung 100μl dung dịch Sol I (lạnh), sau đó lắc nhẹ dịch.
(3) Bổ sung 200μl dung dịch Sol II, đảo nhẹ và để trên đá trong 10 phút.
(4) Bổ sung 150μl dung dịch Sol III (lạnh), đảo nhẹ và để trên đá trong 10 phút.
(5) Sau đó bổ sung 500μl dung dịch chlorofom:isoamyl (24:1), đảo nhẹ và ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút.
(6) Thu dịch nổi và bổ sung thể tích tƣơng đƣơng isopropanol (1:1), để ở nhiệt độ -20o
C trong 20 phút.
(7) Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút, loại dịch nổi.
(8) Rửa tủa 2 lần với ethanol 70% (thể tích mỗi lần là 500μl). Ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút.
(9) Bỏ dịch, thu cặn, làm khô. Cho 40μl H2O có bổ sung RNase, ủ ở 37o C trong 1 giờ.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ (10) Tiến hành phản ứng colony PCR với cặp mồi VrDEF1, điện di để kiểm tra sản phẩm: tiến hành tƣơng tự phản ứng PCR, chỉ khác ở chỗ DNA lấy trực tiếp từ khuẩn lạc. Bảng 2.6. Thành phần phản ứng colony - PCR STT Thành phần Thể tích (μl) 1 PCR Master Mix 7,5 µl 2 DNA khuôn 1,0 µl 3 Mồi VrDEF1-F (10pM/µl) 0,6 µl 4 Mồi VrDEF1-FR (10pM/µl) 0,6 µl 5 H2O 5,3 µl Tổng 15 µl
Chu kỳ nhiệt colony- giống nhƣ chu
trình nhiệt của phản ứng PCR (Hình 2.1).
2.2.2. Phƣơng pháp xác định trình tự nucleotide và xử lý số liệu
Các mẫu plasmid mang cDNA DEF1 đƣợc sử dụng để giải trình tự trên máy xác định trình tự nucleotit tự động ABI PRISM®
3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems – Mỹ).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Chƣơng 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU N
3.1. DEFENSIN 1
Hạt đậu xanh VN6, VN7, VN16 đƣợc xử lý bởi abscisic acid (ABA) để cảm ứng hoạt động gen defensin 1 (DEF1)
3 ng
. Quy trình tách RNA tổng số đƣợc thực hiện với Trizol reagents (Invitrogen).
Không giống DNA, RNA là loại phân tử không bền, dễ bị thủy phân bởi các ribonuclease (RNase). Hơn nữa các RNase lại có mặt ở khắp nơi, hoạt tính mạnh và rất bền, vì thế việc tách chiết RNase đòi hỏi thao tác thật cẩn thận để tránh mọi tạp nhiễm chứa RNase từ môi trƣờng, tất cả các dụng cụ phải đƣợc xử lý trƣớc khi tiến hành thí nghiệm.
Trong quá trình tách chiết, việc nghiền mẫu trong nitơ lỏng để phá vỡ thành tế bào và giải phóng các thành phần trong tế bào đòi hỏi thao tác phải nhanh. Các thành phần bổ sung nhƣ phenol, chloroform:isoamyl nhanh chóng biến tính protein, polysaccharide có trong hỗn hợp, giúp tách pha tốt sau quá trình ly tâm. Sản phẩm RNA tổng số đƣợc hòa tan trong nƣớc 0,1 % DEPC có tác dụng ngăn cản quá trình RNase thủy phân RNA.
Từ RNA tổng số, bằng phản ứng phiên mã ngƣợc đã tạo đƣợc cDNA để tiến hành phản ứng RT-PCR nhân gen DEF1.
RT-PCR, trong quá trình thực hiện, chúng tôi đã tính toán nhiệt độ gắn mồi và tiến hành phản ứng RT-
PCR. phản ứng RT-PCR xảy ra tối ƣu trong điều
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ nhân gen đƣợc kiểm tra trên gel agarose 1% cùng với thang DNA 1kb
ƣợc thể hiện ở hình 3.1. 0,25 kb 0,22 kb 1 2 3 M 3.1. cDNA DEF1 3 VN6, VN7, VN16 nghiên cứu
1- VN6; 2- VN7; 3- VN16; M: DNA Marker 1kb Plus (Fermentas)
Qua hình 3.1 cho thấy, ở 3 mẫu nghiên cứu VN6, VN7, VN16 xuất hiện băng DNA sáng rõ duy nhất có kích thƣớc khoảng 0,22 kb, độ dài của đoạn DNA vừa nhân đƣợc phù hợp với lý thuyết khi thiết kế mồi
d DEF1
AY437639 trên .
3.2. H
cDNA DEF 1
3.2.1. cDNA DEF1 6
Ngoài đoạn gen mong muốn, sản phẩm PCR còn có sản phẩm phụ, các nucleotide dƣ thừa sau phản ứng, mồi, enzyme… Vì vậy, để quá trình biến nạp đạt hiệu quả cao nhất, chúng tôi đã tiến hành tinh sạch (thôi gel) sản
phẩm PCR 6 theo bộ kit AccuPrep PCR
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ biến nạp. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR đƣợc
.
Sản phẩm PCR nhân cDNA sau khi đƣợc tinh sạch bằng kit đƣợc gắn vào vector tách dòng pBT nhờ enzyme nối T4 ligase để tạo vector tái tổ hợp. Phản ứng ghép nối dựa trên nguyên tắc bổ sung giữa hai đầu nucleotide A thò ra ở sản phẩm PCR với Taq - polymerase và hai đầu nucleotide T trên vector tách dòng pBT. Hỗn hợp đƣợc ủ ở 22o
C trong 1 giờ cho phản ứng xảy ra hoàn toàn, sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến chủng E.coli DH5α và đƣợc cấy trải trên môi trƣờng LB đặc (pepton, cao nấm men, NaCl, agarose) có bổ sung kháng sinh carbenicillin (100mg/l), X-gal (40mg/l) và IPTG (100µM). Ủ đĩa ở 37oC trong 16 giờ. Các khuẩn lạc xanh và khuẩn lạc trắng mọc đƣợc trên môi trƣờng chứng tỏ chúng đều mang vector pBT. Khuẩn lạc xanh là các khuẩn lạc mang pBT tự đóng vòng nên vẫn còn khả năng sinh tổng hợp protein β-galactosidase để phân giải cơ chất X-gal từ không màu thành màu xanh. Còn các khuẩn lạc màu trắng do mang vector pBT đã gián đoạn gen lac Z nên không thể phân giải cơ chất thành màu xanh, đây chính là dòng khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp.
Chọn khuẩn lạc màu trắng đem kiểm tra phản ứng colony- PCR với cặp mồi DEF1-F/VrDEF1-R.
- 3.2).
-
a cDNA.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
0,22 kb 0,25 kb
M 1 2 3 4
Hình 3.2. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm colony - PCR
M: DNA Marker 1kb Plus (Fermentas); Giếng 1, 2, 3, 4 dòng khuẩn lạc
3.2.2. DEF1
Trình tự nucleotide của cDNA DEF1 đã tách dòng đƣợc xác định trên thiết bị giải trình tự nucleotide tự động, ABI PRISM® 3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems). đƣợc phân tích
Bioedit BLAST trong NCBI
cDNA DEF1 của đậu xanh là 222 nucleotide. cDNA DEF1
6 với trình tự nucleotide của gen
DEF1 ở đậu xanh đã công bố trên đƣợc ở hình 3.3.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
3.3. S cDNA DEF1
gen
AY437639)
hình 3.3 cho thấy kích thƣớc cDNA DEF1 của giống đậu xanh VN6 và trình tự mang mã số AY437639 đều là 222 bp. Khi so sánh trình tự cDNA DEF1 của giống đậu xanh VN6 bằng BLAST trong ngân hàng gen Quốc tế, kết quả cho thấy cDNA DEF1 của giống VN6 và AY437639 giống nhau 97,7% . Nhƣ vậy, chúng tôi đã khuếch đại, tách dòng thành công và xác định đƣợc trình tự nucleotide của cDNA DEF1 từ giống đậu xanh VN6.
So sánh trình tự nucleotide của cDNA DEF1 phân lập từ giống đậu xanh VN6 xác định đƣợc có 5 vị trí nucleotide sai khác so với trình tự gen
DEF1 của mẫu đậu xanh 437639
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Bảng 3.1. Sự sai khác về trình tự nucleotide của cDNA DEF1 của giống đậu xanh VN6 và các trình tự có mã số AY437639 trên ngân hàng gen Quốc tế
Vị trí
Mẫu 12 41 60 87 112
AY437639 A T G T G
VN6 G C T C C
Bảng 3.1 cho thấy, tại vị trí nucleotide 12 (cDNA DEF1 phân lập từ giống đậu xanh VN6 là G còn gen DEF1 công bố trên ngân hàng gen Quốc tế mã số AY437639 là A), trình tự cDNA DEF1 phân lập từ giống đậu xanh VN6 là C còn gen DEF1 có mã số AY437639 là T ở vị trí 41), vị trí nucleotide 60 (cDNA DEF1 phân lập VN6 là T còn gen DEF1 phân lập trên ngân hàng gen Quốc tế mã số AY437639 là G), vị trí nucleotide 87 (cDNA
DEF1 VN6 là C còn gen DEF1 với mã số AY437639 là T), trình tự cDNA
DEF1 phân lập từ giống đậu xanh VN6 còn có một nucleotide sai khác với trình tự gen DEF1 công bố trên ngân hàng gen Quốc tế có mã số AY437639 tại vị trí nucleotide 112 (cDNA DEF1 VN6 là C còn gen DEF1 trên ngân hàng gen Quốc tế có mã số AY437639 là G)
Khi phân tích , ngoài trình tự nucleotide ngƣời ta còn quan tâm đến trình tự amino acid suy diễn, vì phân tử protein là sản phẩm của gen. Trên cơ sở đó, chúng tôi sử dụng phần mềm BioEdit để tiến hành so sánh trình tự amino acid suy diễn từ cDNA DEF1 của giống đậu xanh VN6 với AY437639 trên ngân hàng gen Quốc tế, kết quả đƣợc trình bày ở hình 3.4.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
DEF1
h VN6 với trình tự mang mã số AY437639 trên ngân hàng gen Quốc tế
3.4 cho thấy, trình tự amino acid suy diễn trong protein
DEF1 73 amino acid
97,3%. Tuy nhiên, hai trình tự này có sự khác nhau ở một vài vị trí amino
acid, :
3.2).
Bảng 3.2. Sự sai khác về trình tự amino acid suy diễn của protein DEF1 ở giống đậu xanh VN6 và trình tự mang mã số AY437639 trên ngân hàng
gen Quốc tế
Vị trí
Mẫu 14 38
AY437639 L (Leucine) G (Glycine)
VN6 P (Proline) R (Arginine)
Kết quả bảng 3.2 cho thấy, trình tự amino acid ở vị trí 14 (L) của giống