Phản ứng chuyển đổi ester giữa sucrose và methylester trong dung môi DMSO với xúc
tác K2CO3 được thực hiện trong bình cầu hai cổ (dung tích 250ml)ở điều kiện áp suất
chân không (600mmHg) theo trình tự như sau:
Sucrose và một lượng xúc tác K2CO3 được cho vào bình cầu 2 cổ, gia nhiệt giảm áp
để bay hơi ẩm. Sau đó, dung môi DMSO được thêm vào bình, điều chỉnh tốc độ
khuấy của bếp để phân tán đều sucrose và K2CO3 trong dung môi. Tiếp tục cho methyl ester vào phản ứng.
Dùng sắc ký bản mỏng để theo dõi sự phản ứng của sucrose và methyl ester acid béo. Tiến hành: 1 ml hỗn hợp được lấy ra khỏi phản ứng, phân lập bằng n-butanol, lấy lớp trên, chấm trên bản mỏng silicagel, dùng pha động là hệ
chloroform:methanol: acid acetic: nước (35:10:4:1 v/v/v/v). Hiện màu TLC bằng
cách phun dung dịch H2SO4 10% trong ethanol và nung nóng ở 1100C trong 5 phút [19].
chưng cất bằng hệ n-butanol : NaCl 10% (1:1 v/v) ở 600C. Cho hỗn hợp dung dịch
vào phểu chiết, chiết lấy lớp trên. Tiếp tục chiết với dd NaCl 10% để loại K2CO3 (dùng giấyquỳkiểm tra pH) và sucrose dư.
Cô quay loạidung môi trong dịchchiết ởtrên ta thuđược hỗnhợp sản phẩm.
Hình 2.6: Sơ đồlắphệ phản ứng chuyển đổiester tạo sucrose ester
Khảo sát tuần tự các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng chuyển đổi ester: tỷ lệ đương lượng tác chất, thời gian, nhiệt độ, lượng xúc tác bằng cách thay đổi
yếu tố khảo sát, giữcố địnhcác thông sốcòn lại.
Để khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ đương lượng tác chất, thực hiện phản ứng chuyển đổi ester ở 900C trong 5h [35] với 10% khối lượng K2CO3 so với methyl methyl ester [36]. Để tạo được nhiều sucrose mono-ester trong hỗn
hợp sản phẩm, chọn khảo sát ở 4 tỷ lệ mol sucrose/methyl decanoate là 1:1, 2:1, 3:1, 4:1.
Sản phẩm thu được ứng với điều kiện phản ứng khác nhau được quét phổ LC-MS ở Phòng Phân tích Dược liệu - Labo Hóa học cây thuốc - Đại
học Y Dược - Số 41 Đinh Tiên Hoàng - Q1 - Tp. HCM để xác định thành phần các chất, đồng thời dùng làm chuẩn so sánh giữa các kết quả tổng hợp với nhauđể chọn tỷ lệ đương lượng tác chấtphù hợp. Tỷlệ nàyđược dùngđể
khảo sát các yếu tốtiếp theo.
chất đã chọn được ở trên, nhiệt độ phản ứng 900C [35], 10% khối lượng K2CO3 so với methyl ester [36], thời gian được thay đổi: 3 [14], 4, 5, 7 [25]. So sánh độ hòa tan của các chất trong nước, chọn thời gian phản ứng cho sản
phẩm có hàm lượng sucrose monoester cao nhất và thấp nhất. Thời gian này
được dùngđể khảosát tiếpsự ảnhhưởng của nhiệt độ và lượng xúc tác.
Nhiệt độ phản ứng được khảo sát bằng cách cố định 3 thông số: tỷ lệ đương lượng tác chất, thời gian phản ứng đã chọn được ở trên và 10% khối
lượng K2CO3 so với methyl ester, nhiệt độ phản ứng được thay đổi: 70 [25], 80 [14], 90, 100 [25]. Vẫndùng cách phân tích và so sánh kếtquảtương tự như khi chọn thời gian, chọn được nhiệt độ phản ứng đểkhảo sát tiếp sự ảnh hưởng yếutốcòn lại đến phản ứng chuyển đổi ester.
Bằng cách cố định 3 thông số: tỷ lệ đương lượng tác chất, thời gian, nhiệt độ phản ứng đã chọn được ở trên, sự ảnh hưởng của lượng xúc tác được khảo sát khi thay đổi % khối lượng K2CO3 so với methyl ester lần lượt: 5, 10, 15, 20, 25% [36]. Dùng cách phân tích và so sánh kết quả tương tự như
Hình 2.7. Quy trìnhđiều chế sucrose ester sử dụng dung môi
2.5.4 Quy trình không sử dụng dung môi [50]
Phản ứng được thực hiện trong bình cầu 100mL, có hệ thống khuấy cơ và thiết bị hút
chân không.
Methyl ester, sucrose, xúc tác K2CO3 và Na-stearate được đưa vào bình cầu. Hệ thống
phản ứng được đưa đến áp suất p = 60mmHg,
Sau thời gian phản ứng, hỗn hợp thô sau phản ứng sẽ được chiết trong môi trường n-
butanol/nước (1:1 v/v) ở nhiệt 600C và được trung hòa bằng H2SO410%.
Sau đó dung dịch được đem đi lọc, dung dịch dưới lọc bị phân làm 2 lớp. Tách lấy lớp
Hình 2.8. Quy trìnhđiều chế sucrose ester không sử dụng dung môi
2.5.4Xác định các tính chất sucrose ester 2.5.4.1 Phân tích LC/MS
Phổ LC/MS của sucrose ester các acid béo được ghi nhận từ máy tại phòng phân tích hóa học cây thuốc của trường Đại học Y dược, số 41 Đinh Tiên Hoàng, p. Bến Nghé, quận 1, Tp. HCM
Điều kiện sắc ký:
- Hiệu máy: Quarter, - Phần mềm Masslyxn 4.0 - Chế độ chạy: Negative polarity,
- Cột Nucleosil 100–C18 (250 × 4.6 mm) - Hòa tan mẫu trong methanol
- Phađộng: Methanol/Nước Thời gian CH3OH % H2O % Tốc độdòng 0 85 15 1 ml/phút 10 85 15 11 95 5 1 ml/phút 15 95 5 [
Điều kiện quét MS: Scan toàn diện.Mức scan: 1.0 scan/s
2.5.4.2Đo sức căng bề mặt
Sức căng bề mặt được xác định trong môi trường nước ở nhiệt độ phòng 250C ±2 với máy đo sức căng bề mặt CSC-DuNouy Model 70545. Máy đo này dựa trên nguyên tắt vòng Du Nouy.
Tiến hành đo SCBM một dãy các dung dịch nồng độ chất HĐBM khác nhau: 0;
0.02%; 0.04%; 0.06%; 0.08%; 0.1%; 0.3%; 0.5%; 1% nhằm xác định được chỉ số
micelle tới hạn của chất tạo nhũ.
Thí nghiệm được tiến hành phân tích tại Viện Công Nghệ Hóa Học, số 01 Mạc Đĩnh Chi, P. Bến Nghé, quận 1, Tp. HCM.
2.5.4.3 Đo độ ổn định của nhũ W/O (nước trong dầu) và O/W (dầu trong nước)[11, 15, 34]
Độ ổn định của nhũ tương dầu trong nước (O/W) ở nhiệt độ phòngđược đánh giá ở nồng độ nhũ 0.5% và 10% nồng độ dầu. Nồng độ chất tạo nhũ được phân tán vào trong nước. Sau đó dung dịch này được đưa vào máy trộn, vừa khuấy trộn
nhẹ, vừa thêm chậm chậm vào. Hỗn hợp được khuấy trộn bằng máy khuấy đồng
nhất trong 2 phút. Nhũ được tạo thành sẽ được chuyển vàoống đong 100mL và
để ở nhiệt độ phòng. Thể tích pha nước được tách ra ở phần dước được đo lại sau
thời gian 0; 0.5; 1; 2; 4; 8; 20; 24; 48 h.
Độ ổn định nhũ trong dầu được xác định ở nồng độ nhũ 0.5% và 10% nồng độ nước. Nhũ được phân tán vào trong dầu. Sau đó vừa khuấy nhẹ, vừa cho từ từ nước vào. Hỗn hợp được khuấy trộn bằng máy khuấy đồng nhất trong 2 phút.
Nhũ được tạo thành được cho vào ống đong dung tích 100mL. Độ ổn định của
nhũ được đo bằng thể tích nước tách ra ở pha dưới trong thời gian 0; 0.5; 1; 2; 4;
8; 20; 24; 48h.
Dựa vào độ ổn định của nước trong dầu ta có thể xác định sơ bộ chỉ số HLB của
sản phẩm như sau:
- Hoà tan mẫu vào nước và dự đoán ch ỉ số HLB theo bảng sau [15]:
Bảng 2 .1. Bảng dự đoán chỉ số HLB theo khả năng hòa tan trong nước [15]
Khả năng tan trong nước Chỉ số HLB Phương pháp nhũ
Không phân tán trong nước 1 - 3
Phân tán trong nước kém 3–6 W/O
Dung dịch phân tán dạng sữa 6 - 9 Chất thấm ướt
Trong mờ đến trong 10 - 13 O/W
Tan tốt 14 - 18 O/W
Dựa vào chỉ số HLB dự đoán, xác định ph ương pháp đánh nhũ: W/O hay O/W. Đánh nhũ sản phẩm với các loại dầu có chỉ số HLB tương ứng với khoảng HLB xác định. Kiểm tra độ ổn định của nhũ.
Thí nghiệm được tiến hành phân tích tại Viện Công Nghệ Hóa Học, số 01 Mạc Đĩnh Chi, P. Bến Nghé, quận 1, Tp. HCM.
2.5.4.4Đo độ giảm cấp sinh học [40]
Độ giảm cấp sinh học xác định bởi tiêu chuẩn “ISO 7827 – Evaluation in an Aqueous Medium of the Aerobic Organic Carbon (DOC)”.
Phương pháp tiến hành: 800mL môi trường giảm cấp sẽ được chuẩn bị trong chai 1 lít . Môi trường này có pH 70.1 và chứa những khoáng chất, chất dinh dưỡng
cần cho sự phát triển của vi sinh vật. Môi trường được hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút.
Hợp chất cần kiểm tra được thêm vào môi trường, đồng thời mỗi một môi trường được nuôi cấy với 7mL bùn chứa vi khuẩn hiếu khí hoạt động. Môi trường nuôi
cấy được đặt trên bàn lắc với tốc độ 120 – 150rpm và được lắc liên tục trong suốt
quá trình lắc ở nhiệt độ phòng.
Kèm theo mỗi quá trình kiểm tra mẫu là:
- Mẫu trắng: chứa môi trường kiểm tra mẫu và bùn có chứa vi khuẩn hiếu khí.
- Mẫu đối chứng: chứa môi trường kiểm tra mẫu, bùn và một vật liệu chuẩn được xem là có độ giảm cấp sinh học nhanh: Sodium acetate.
- Mẫu môi trường: chứa môi trường kiểm tra mẫu.
Mẫu sẽ được lấy ra phân tích DOC 1 lần/ngày (khoảng 35mL). Thời gian theo dõi trong 1 tuần.
DOC được phân tích bằng kỹ thuật NPOC (acid hóa , loại bỏ carbon vô cơ) của
Bảng 2.2 Môi trường đo độ giảm cấp sinh học
STT Tên hoá chất Công thức hoá học Hàm lượng
(M)
1 Potassium dihydrogen phosphate KH2PO4 6.2 x 10-4 2 Potassium hydrogen phosphate K2HPO4 1.25 x 10-4 3 Sodium hydrogen phosphate Na2HPO4 1.27 x 10-3 4 Ammonium chloride NH4Cl 4.67 x 10-4 5 Magnesium sulfate heptahydrate MgSO4.7H2O 8.9 x 10-5 6 Calcium chloride hexahydrate CaCl2.6H2O 1.25 x 10-4 7 Iron (III) chloride hexahydrate FeCl3.6H2O 9.2 x 10-7 8 Manganese sulfate tetrahydrate MnSO4.4H2O 1.79 x 10-7
9 Acid boric H3BO3 9.25 x 10-7
10 Zin sulfate heptahydrate ZnSO4.7H2O 1.48 x 10-7 11 Ammonium heptamolybdate tetrahydrate (NH4)6Mo7O24.4H2O 2.98 x 10 -8 12 Phức Iron C10H12N2O8Fe(III)Na 2.6 x 10-7 13 Yeast extract 0.15 mg/L Độ giảm cấp được tính: Trong đó:
C0: nồng độ carbon hòa tan lúc ban đầu (ppm)
Ct: Nồng độ carbon theo thời gian (ppm)
2.5.4.5.Xác định kháng khuẩn [23]
Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được tiến hành để đánh giá hoạt tính
kháng sinh của các mẫu chiết được thực hiện theo phương pháp hiện đại của
Vander Bergher.
Các chủng vi sinh vật kiểm định:
Vi khuẩn Gr (-): Escherichia coli (ATCC 25922)
C0- Ct C0
x 100
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25923)
Vi khuẩn Gr (+): Bacillus subtillis (ATCC 27212) Staphylococcus aureus (ATCC 12222)
Nấm sợi: Aspergillus niger (439)
Fusarium oxysporum (M42)
Nấm men: Cacdida albicans (ATCC 7745) Saccharomyces cerevisiae (SH 20)
Chứng dương tính:
Ampicilin cho vi khuẩn Gr (+)
Tetracyline cho vi khuẩn Gr (-)
Nystatin hoặc Amphotericin B cho nấm sợi và nấm men.
Kháng sinh pha trong DMSO 100% với nồng độ thích hợp: Ampxilin
50mM, Tetracylin: 10mM; Nystatin: 0.04mM. Chứng âm tính:
Vi sinh vật kiểm định không trộn kháng sinh và chất thử. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật:
Môi trường duy trì và bảo tồn giống: Saboraud Dextrose Broth (SDB)-sigma cho nấm men và nấm mốc. Vi khuẩn trong môi trường Trypcase Soya Broth
(TSB)-sigma.
Môi trường thí nghiệm: Eugon Broth (Difco, Mỹ) cho vi khuẩn, Mycophil
(Difco, Mỹ) cho nấm.
Tiến hành thí nghiệm:
Các chủng kiểm định được hoạt hóa và pha loãng tới nồng độ 0.5 đơn vị Mc
Fland rồi tiến hành thí nghiệm Đọc kết quả:
Kết quả đọc sau khi ủ các phiến thí nghiệm trong tủ ấm 370C/24h cho vi khuẩn và 300C/ 48h đối với nấm men, nấm sợi.
Kết quả dương tính là nồng độ màở đó không có vi sinh vật phát triển. Khi
nuôi cấy lại nồng độ này trên môi trường thạch đĩa để kiểm tra, có giá trị
CFU<5.
Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC – Minimum Inhibitory concentration) của chất
hoạt tính: Các mẫu đã có hoạt tính được sàng lọc ban đầu, được pha loãng theo các thang nồng độ thấp dần, từ (5 –10) thang nồng độ để tính giá trị nồng độ tối
thiểu màở đó vi sinh vật bị ức chế phát triển gần như hoàn toàn.
Mẫu thô có MIC≤200 µg/ml; mẫu tinhcó MIC≤ 50 µg/ml là có hoạt tính.
Mẫu được xác định độ kháng khuẩn tại phòng Sinh học Thực nghiệm –Viện Hóa học
các Hợp chất Thiên nhiên –18 Hoàng Quốc Việt, Quận Cầu Giấy, Hà Nội.
2.5.5. Phân tích hàm lượng tạp chất trong sản phẩm sucrose ester [26] 2.5.5.1 Xác địnhchỉ số acid
Chỉ số acid trong mẫu sản phẩm sucrose ester không được lớn hơn 6% theo tiêu
chuẩn quy định không được quá 6.
- Cân chính xác 3g mẫu.
-Hòa tan mẫu trong 40ml iso propyl alcohol và 20 ml nước cất.
Dung dịch sau khi hòa tanđược chuẩn độ với dung dịch KOH 0.1N, sử dụng
chất chỉ thị là dung dịch phenolphthalein.
Chỉ số acid = V (ml) x 5.611/ m
V : thể tích KOH chuẩn độ (ml)
m: khối lượng mẫu ban đầu (g)
2.5.5.2 Xác định hàm lượng đường tự do
Cân chính xác 2g mẫu sucrose ester, hòa tan trong 40ml n-butanol, hòa tan ở
nhiệt độ 500C, chiết dung dịch hai lần với 20ml dung dịch NaCl 10%.
Kế hợp hai dịch chiết, thêm 2ml dung dịch acid HCl 10%. Khấy trộn 700C trong 30 phút. Để nguội, thêm 2 -3 giọt phenolphthalein, trung hòa với dung dịch NaOH 1N. Sau đó, định mức dung dịch đến 100ml bằng nước.
Lấy 20ml dung dịch trên cho vào cốc. Thêm 20ml dung dịch Bertrand A, 20ml
dung dịch Bertrand B, đun sôi nhanh trong 3 phút, sau đó để lắng tạo kết tủa đồng oxid. Lọc và rửa kết tủa đến khi tủa không còn có tính kiềm.
Hòa tan hoàn toàn tủa bằng 20ml dung dịch Bertrand C, cho dịch hòa tan vào erlen 250ml . Chuẩn độ với dung dịch Bertrand D. Từ dung dịch chuẩn độ tính được hàm lượng đồng thu được. Từ đó xác định được lượng đường khử từ bảng
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Methyl ester
3.1.1. Điều chế Methyl octanoate
Khối lượng octanoic acid 910g từ công thức (CT 2.2) ta tính được khối lượng MC8E lý thuyết m = 998.5g.
Khối lượng MC8E thực tế thu được: m’= 958g,
Từ công thức (CT 2.1) ta tínhđược hiệu suất tổng hợp MC8E là 95.9%.
Nguyên liệu trung gian methylester sau khi điều chế được làm sạch rồi được phân tích bằng phương pháp GC/MS.
Kết quả phân tích như sau:
Hình 3.1 Kết quảGC/MS của methyl octanoate
Nhận xét:
Dựa vào phổGCởtrên ta thấy được rằng chất sau khi điều chếra rất tinh khiết vì chỉ
cho ra một mũi mạnhởthời gian là 7.99 phút.
Sau khiđược phân tích qua GC, sản phẩm tiếp tục được phân tích bởi máy đo khối phổ
Hình 3.2 Kết quảGC/MS của methyl octanoate
Biện luận cấu trúc của methyl Octanoate
Mũi 158: mảnh methyloctanoate còn nguyên
Mũi 127: mảnh methyloctanoate sau khi bịphân tách ra khỏi mảnh O-CH3 Mũi 87: mảnh H2C–H2C–COO+–CH3
Mũi 74: đây là mũi đ ặc trưng để nhận danh khối phổ của ester methyldây dài từ C6–
C26. Các hợp chất ester methylcó đứt nối β kèm theo sự chuyển vị một Hγ trong chuyển vị McLafferty đểcho ra mảnh 74.
Mũi 59: mảnh COOCH3 sau khi methyl octanoate bị tách mạch alkyl mạch thẳng.
Như vậy, đây là khối phổcủa methyloctanoate đãđư ợc điều chế. Từkết quảphân tích cho thấy độtinh khiết của sản phẩm đạt 100%.
3.1.2. Điều chế Methyl decanoate
Với m decanoic acid = 830g, từ công thức (CT 2.2) ta tính được khối lượng
Khối lượng MC10E thực tế thu được: m’= 840g,
Từ công thức (CT 2.1) ta tínhđược hiệu suấttổnghợp MC10E là 93.59%.
Hình 3.3: KếtquảGC của methyl decanoate
Nhận xét:
Dựa vào phổ GC ở trên, ta thấy sản phẩm điều chế được khá tinh khiết vì chỉ
cho một peak có cường độ rất mạnh ở thời gian là 10.87 phút và một peak có
cườngđộ rấtnhỏ ởthời gian 11.65 phút.
Sau phân tích bằng sắc ký khí, sản phẩm tiếp tục được đưa vào bộ phận phân tích của máy khối phổvà cho khốiphổ đồ nhưsau:
Hình 3.4: Khốiphổ củamẫumethyl decanoate tổng hợpđược
Biệnluận cấu trúc củamethyl decanoate:
- Mũi 186:mảnh phântửmethyl decanoate chưa bị phântách.
- Mũi 155:mảnhcòn lại của methyl decanoate sau khi bị phântách OCH3. - Mũi 143:mảnhcòn lại của methyl decanoate sau khi bị phântách C3H7.