5. Giới hạn đề tài
2.2.3.Phương pháp phân tích định lượng vi sinh vật
- Hút chính xác 100 µl mẫu, cho vào đĩa peptri (cĩ mơi trường đặc trưng + agar) vơ trùng và trải đều trên bề mặt thạch. Thực hiện pha lỗng mẫu trong dung dịch NaCl 0,5%. Các dụng cụ tiến hành thí nghiệm đều vơ trùng và mọi thao tác được thực hiện trong điều kiện vơ trùng. Thí nghiệm thực hiện ở ba độ pha lỗng liên tiếp, mỗi độ pha lỗng thực hiện 3 đĩa peptri. Thí nghiệm
lặp lại hai lần, ủ 1-2 ngày, đếm khuẩn lạc xuất hiện trên các đĩa cĩ số khuẩn lạc từ 10 đến 100. Lượng vi sinh vật cĩ trong mẫu được tính như sau:
N A(CFU/ml(g))=
n1Vf1+….+niVfi
Trong đĩ: A (Colony Forming Unit/ml): đơn vị hình thành khuẩn lạc trong 1 ml mẫu.
N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa được chọn. V: thể tích mẫu cấy vào mỗi đĩa (ml).
ni: số lượng đĩa cấy tại độ pha lỗng thứ i. fi: độ pha lỗng tương ứng.
►Phương pháp pha lỗng dung dịch
Chuẩn bị ống nghiệm: lấy đủ ống nghiệm cho mục đích pha lỗng. Rửa sạch ống nghiệm và sấy khử trùng ở 160oC trong 1 giờ. Đặt ống nghiệm vào buồng cấy vơ trùng và bật đèn cực tím trong 30 phút.
Hút 9 ml nước muối sinh lý vơ trùng cho vào các ống nghiệm. Hút 1 ml dung dịch mẫu cho vào ống nghiệm thứ nhất, lắc đều. Sau đĩ, hút 1 ml dịch từ ống thứ nhất sang ống thứ hai rồi lắc đều và cứ như vậy tiếp tục hút sang các ống tiếp theo cho đến nồng độ cần pha. Khi được dung dịch cĩ nồng độ cần thiết ta tiến hành cấy trải lên các đĩa peptri.
►Phương pháp chuẩn bị giống thí nghiệm
Chuẩn bị các bình tam giác chứa 100 ml mơi trường nuơi cấy đã khử trùng để hoạt hĩa giống. Dùng que cấy lấy giống từ các ống giống đưa vào các bình tam giác, lắc đều bằng tay hoặc bằng máy lắc để hoạt hĩa giống trong 24 giờ ở nhiệt độ phịng 28-30oC. Giống hoạt hĩa này được sử dụng cho các thí nghiệm trong quy trình nuơi cấy.
Lưu ý: Tất cả các dụng cụ đều phải vơ trùng và mọi thao tác phải được thực hiện trong box cấy vơ trùng.