5. Giới hạn đề tài
2.2.2. Phương pháp phân lập và bảo quản mẫu
2.2.2.1. Phân lập vi sinh vật
Phân lập vi sinh vật là quá trình tách riêng các lồi vi sinh vật từ quần thể ban đầu.
2.2.2.1.1. Nguyên tắc
- Tách rời các tế bào vi sinh vật.
- Nuơi cấy các tế bào trên trong mơi trường dinh dưỡng đặc trưng để cho khuẩn lạc riêng rẽ, cách biệt nhau.
2.2.2.1.2. Quá trình phân lập vi sinh vật ở dạng thuần khiết
Với hầu hết các loại mẫu nghiên cứu, quá trình phân lập vi sinh vật ở dạng thuần khiết gồm các bước cơ bản:
- Tạo ra các khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể vi sinh vật ban đầu (mẫu ở dạng lỏng).
+ Tiếp tục pha lỗng ở nồng độ cần thiết. + Cấy mẫu trên mơi trường đặc trưng của nĩ.
+Hút 0.1 ml dịch mẫu đã pha lỗng cho vào đĩa peptri cĩ mơi trường thích hợp.
+ Dùng que gạt thủy tinh phân phối dịch mẫu trải đều khắp mặt thạch, ta sẽ nhận được các khuẩn lạc riêng rẽ.
- Kiểm tra độ tinh khiết của giống mới phân lập. + Kiểm tra vết cấy:
Quan sát sự sinh trưởng của vi sinh vật qua vết cấy trên mơi trường đặc. • Nếu vết cấy cĩ bề mặt và màu sắc đồng đều, thuần nhất chứng tỏ giống mới phân lập tinh khiết thì giữ lại.
• Nếu vết cấy khơng đồng nhất thì loại bỏ. + Kiểm tra lại độ thuần chủng của các khuẩn lạc
• Chọn các khuẩn lạc riêng rẽ trên mơi trường thạch nghiêng.
• Tách các khuẩn lạc này ra và hịa tan, pha lỗng ở nồng độ cần thiết trong nước cất vơ trùng.
• Nhỏ 1 giọt dịch trên vào đĩa peptri cĩ mơi trường.
• Dùng 1 que gạt phân phối giọt dịch đều khắp mặt thạch đĩa peptri. • Đặt đĩa peptri trên vào tủ ấm với nhiệt độ và thời gian thích hợp tùy loại vi sinh vật.
• Sau lấy ra quan sát các khuẩn lạc riêng rẽ. Sự thuần khiết của khuẩn lạc là biểu hiện sự thuần khiết của giống.[10]
2.2.2.2. Phương pháp mơ tả đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh học
- Mơ tả các đặc điểm sinh học, hình thái của các lồi dưới kính hiển vi. Sau khi nuơi cấy 24h tiến hành quan sát khuẩn lạc đơn dưới kính lúp để xác định hình dạng, cấu trúc, màu sắc, mặt cắt ngang.[2]
- Làm tiêu bản với thuốc nhuộm methyl blue và quan sát tế bào bằng kính hiển vi quang học ở độ phĩng đại 100×10.
- Bacillus subtilis (dương tính với catalase) và Lactobacillus acidophilus (âm tính với catalase). Vi khuẩn cĩ enzyme catalase để phân hủy H2O2, đây là phản ứng giúp phân biệt hai vi khuẩn này.
• Trên một lame sạch, đặt một giọt nước oxy già (H2O2).
• Dùng dây cấy lấy chính xác khuẩn lạc cần thử đặt vào giọt oxy già. • Nếu cĩ bọt khí sủi lên là catalase dương tính, ngược lại là âm tính.
- Nitrosomonas sp.
•Mơi trường đã hấp khử trùng và bổ sung 1ml mẫu cấy, ủ ở 30oC trong 48h. •Lấy vài tinh thể diphenylamine hịa tan trong 1 giọt H2SO4 đậm đặc. Sau đĩ thêm một giọt dịch cần kiểm tra. Tiến hành trên bản sứ trắng sẽ thấy xuất hiện màu xanh thẫm.
2.2.2.3 Bảo quản và giữ giống
Bảo quản và giữ giống thí nghiệm bằng cách cấy truyền trong đĩa peptri và ống thạch nghiêng. Dùng que cấy hơ trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội, sau đĩ gạt nhẹ lên khuẩn lạc rồi ria lên mặt thạch của đĩa và ống theo những hình dạng khác nhau. Dùng nút bơng đã khử trùng miệng ống, đầu ống được gĩi kín bằng giấy báo đã được khử trùng. Ghi ngày tháng cấy lên đĩa và ống, sau đĩ để vào tủ ấm 30oC. Sau 1-2 ngày, khi khuẩn lạc đã mọc đều và mạnh, gĩi bọc ống giống và để vào tủ lạnh khoảng 0-4oC. Các ống giống cĩ thể giữ được trong thời gian là 1-2 tháng và phải cấy truyền giữ giống trong khoảng thời gian đĩ.[9]