a/ Tăng sinh.
− ðồng nhất 25g mẫu trong 225ml môi trường tăng sinh LB I trong 30 giây. Ủ 300C trong 24h. Chuyển 0.1 ml LB I sang ống 10 ml LB II, tiếp tục ủở 300C trong 24 giờ.
− Quy trình tăng sinh một giai ñoạn ñược thực hiện như sau : Cân 25g mẫu, thêm vào 225ml canh EB ( ñã ñược làm ấm ở 450C nếu mẫu thử là các sản phẩm sữa và ở 300C ñối với các sản phẩm khác ) và tiến hành ñồng nhất mẫu trong 30 giây. Ủở 300C trong 48 giờ.
− Quy trình tăng sinh một giai ñoạn ñược thực hiện như sau: Cân 25g mẫu, thêm vào 225ml canh EB (ñã ñược làm ấm ở 450C nếu mẫu thử là các sản phẩm khác ) và tiến hành ñồng nhất mẫu trong 30 giây, ủ ở 300C trong 48h.
b/ Phân lập.
− Phân lập Listeria monocytogenes trên môi trường OXFORD.
Dùng tăm bông vô trùng thấm dịch mẫu từ ống tăng sinh, trải sang ½
ñĩa môi trường Oxford Agar. Từ những vệt cấy này dùng que cấy vòng ria sang ½ ñĩa còn lại. Ủ ở 370C trong 24-48h. Trên môi trường này khuẩn lạc Listeria monocytogenes có màu xám hay màu nâu ñược bao quanh bởi vòng ñen, khuẩn lạc lõm, nhỏ, ñường kính khoảng 1mm.
− Phân lập Listeria monocytogenes trên môi trường PALCAM.
Dùng pipet hút 0.1 ml mẫu cho vào môi trường thạch Palcam, sau ñó tiến hành cấy trang ( trang ñến khi thấy môi trường lan ñều mặt thạch là ñược). Sau ñó, ñem ủ ở 370C trong vòng 48 giờ. Sau 48 giờ lấy ra quan sát, ta thấy khuẩn lạc Listeria monocytogenes có màu xám ñến
xanh lá cây, có tâm màu ñen. Môi trường xung quanh chuyển sang màu xanh ñen.
c/ Khẳng ñịnh Listeria monocytogenes bằng các thử nghiệm sinh hóa.
− Thử khả năng tan huyết.
Chọn khuẩn lạc ñiển hình trên môi trường thạch Oxford, dùng que cấy vòng,cấy truyền sang môi trường thạch máu, ủở 370C, 24-48 giờ. Trên môi trường thạch máu, khuẩn lạc Listeria monocytogenes ñược bao quanh bởi vòng tán huyết hẹp do hiện tượng dung huyết dạng β vòng tan huyết trong và rõ. Trước khi tiền hành thử nghiệm khẳng ñịnh, cấy chuyền khuẩn lạc nghi ngờ là vi khuẩn Listeria monocytogenes sang
môi trường lỏng không chọn lọc, ủ ở 250C, trong 20 giờ. - Thử nghiệm Catalase.
Nguyên tắc: Các vi sinh vật kỵ khí và hiếu khí tùy nghi chứa chuỗi
ñiện tử có cytochrome ñều có enzyme catalase (trừ các Streptococcus.spp). Enzyme catalase có vai trò bảo vệ tế bào khỏi các tổn thương bởi các dẫn xuất ñộc tính cao của oxy phân tử trong tế bào vi sinh vật. Các vi sinh vật có khả năng biến dưỡng năng lượng theo phương thức với oxy là chất nhận ñiện tử cuối cùng trong chuỗi truyền
ñiện tử tạo H2O2. Catalase thủy phân hydrogen peroxide (H2O2) thành H20 và O2, ngăn cản sự tích tụ của phân tử có ñộc tính cao này trong tế
bào. Sự thủy phân hydrogen peroxide sẽ giài phóng O2 ñược ghi nhận qua sự sủi bọt khí.
Chủng làm ñối chứng của thử nghiệm này là Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis.
Hình 3.1. thử nghiệm Catalase.
Phương pháp tiến hành: Hóa chất dùng ñể tiến hành thử nghiệm là: Hydrogen Peroxide 30%, dung dịch ñệm Photphate pH 7.0.
− Thử trên lame.
Dùng que cấy thẳng cấy lấy một ít sinh khối từ khuẩn lạc thuần ñặt trêm lame, nhỏ 1 giọt H2O2 30% lên sinh khối vi sinh vật trêm lame, nhỏ 1 giọt H2O2 0.5% rồi ñậy lại bằng lamelle. Nếu dương tính sẽ xuất hiện bọt khí bị giữ lại giữa lame và lamelle.
− Thử nghiệm trên ñĩa Petri.
Nhỏ trực tiếp 1ml H202 30% lên sinh khối chủng thuần trên bề mặt thạch. Nếu dương tính sẽ xuất hiện sủi bọt quanh sinh khối.
− Thử nghiệm Oxidase.
Nguyên tắc:
Xác ñịnh sự hiện diện của hệ enzyme oxidase ở vi sinh vật. Enzyme quan trọng nhất là cytochrome oxidase trong chuỗi truyền ñiện tử của hô hấp hiếu khí với O2 là chất nhận ñiện tử cuối cùng , chỉ hiện diện ở
các lòai hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi. Họat tính cytochrome oxidase
ñược phát hiện nhờ thuốc thử p- phenylenediamine. Trong ñiều kiện có sự hiện diện của cytochrome C khử trong tế bào, thuốc thử này bị oxy hóa thành một hợp chất indophenol có màu xanh dương. Chủng dùng làm ñối chứng là (+) Pseudomonas aerugnosa, (-) Acinetobacter lwoffi.
Phuơng pháp tiến hành.
Cách 1: cấy sinh khối chủng thuần lên ống thạch nghiêng Nutrien Agar,
ủ ở nhiệt ñộ thích hợp trong 24-48 giờ. Nhúng một mành giấy lọc vào dung dịch 1% teramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride hoặc oxalate. Dùng que cấy vòng thu lấy sinh khối, dàn ñều lên vị trí có thuốc thử trên giấy lọc. Nếu không xuất hiện màu xanh thì phản ứng âm tính.
Cách 2: Cấy sinh khối chủng thuần lên ống thạch nghiêng Nutrien Agar, ủ ở nhiệt ñộ thích hợp trong 24-48 giờ. Nhỏ lên sinh khối vào giọt mỗi lọai thuốc thử mới pha là 1% p-aminodimethyaniline oxalate và 1% α-napthol trong ethanol. Nếu không xuất hiện màu xanh thì phản ứng âm tính.
− Thử nghiệm tính di ñộng.
Nguyên tắc.
Vi sinh vật họat ñộng di chuyển ñược là nhờ tiêm mao. Khả năng di
ñộng có thể dùng ñể phân biệt các vi sinh vật, khả năng này ñược quan sát nhờ sự tăng trưởng và di ñộng của vi sinh vật vào bên trong thạch mềm.
Chủng dùng ñể làm ñối chứng là: Serratia marcescens, Acinetobacter lwoffi.
Phuơng pháp tiến hành.
Sử dụng môi trường thạch mềm chứa 0.5% agar. Môi trường ñược ñun tan chảy, phân phối thành dung tích 5ml vào ống nghiệm vô trùng, hấp khử trùng ở 1200C trong 15 phút. Các ống môi trường này ñược làm nguội ở trạng thái ñứng và bảo quản 4-100C. Dùng que cấy thẳng thu lấy sinh khối từ khuẩn lạc của chủng thuần sau khi ủ ở nhiệt ñộ thích hợp. Chủng ñược cấy bằng cách ñâm sâu ñầu que cấy xuyên vào giữa môi trường trong ống nghiệm ñến ñộ sâu khoảng 2cm . Các ống môi trường ñược ủ ở 370C trong 24/48 giờ. Thực hiện song song với việc ủ ở ñiều kiện tương tự một ống môi trường không ñược cấy vi sinh vật dùng làm ống ñối chứng.
Ống ñối chứng không có vi sinh vật tăng trưởng, môi trường trong. Nếu sử dụng môi trường thạch mềm mà trong ống nghiệm có Listeria monocytogenes thì Listeria monocytogenes sẽ mọc lan khỏi ñường cấy theo hình dù và làm vẫn ñục môi trường xung quanh.
− Khả năng biến dưỡng ñường.
Nguyên tắc.
Xác ñịnh khả năng sử dụng một nguồn carbon nhất ñịnh của vi sinh vật
ñể tăng trưởng.
Phương pháp tiến hành.
Ủ các ống canh trùng thử khả năng lên men ñường ở 370C trong 7 ngày. Kết quả (+) (màu vàng) thường quan sát ñược trong vòng 24-48 giờ. Listeria monocytogenes lên men rhamnose nhưng không có khả
năng lên men xylose.
Nguyên tắc.
Phản ứng CAMP là phả ứng phối hợp giữa nhân tố protein tiết bởi các
loài Streptococcus nhóm B với nhân tố β-hemolysin tiết ra bởi chủng
Streptococcus aureus gây ra hiện tượng làm tan hồng cầu của cừu hoặc bò trên môi trường thạch màu. Nhân tố CAMP có vai trò tăng cường hoạt tính photpholipase C xúc tác thuỷ phân thành phần chủ yếu của màng hồng cầu cừu hoặc bò là β-hemolysin. Photpholipase C thuỷ
phân lecithin ở màng ngoài tạo thành các diglyceride, photphatidyl choline và ceramide. Ceramide và diglyceride kết tụ với nhau thanh những giọt ñặc. Nhân tố CAMP tác dụng lên các khối tụ này tạo ra khoảng trống trên màng ngoài giúp cho photpholipase C có ñiều kiện tiếp xúc và thuỷ phân sphigomelin ở màng trong làm hồng cầu dễ vỡ. Trong thử nghiệm CAMP người ta tiến hành cấy chủng kiểm nghiệm cùng với một chủng Staphylococcus tạo nhiều β-lysin lên môi trường thạch máu ñược bổ sung máu cừu hay bò. Nếu chủng kiểm nghiệm CAMP thì sẽ xuất hiện ñường tan huyết ở vùng lân cận chung của
ñường cấy chủng kiểm nghiệm và Saccharomyces aureus.
Phương pháp tiến hành.
Trên ñĩa thạch dung ñể thử CAMP, cấy Saccharomyces aureus thành
một ñường cấy mỏng, tương tự cấy Rhodocus equi ñể tạo thành 2
ñường cấy song song cách nhau 4cm.
Cấy chủng nghi ngờ Listeria monocytogenes ở giữa, gần nhưng không chạm vào 2 ñường cấy song song của Staphylococcus aureus và Rhodococus equi. Có thể cấy một hoặc nhiều dòng vi khuẩn nghi ngờ
một ñĩa. Cấy chủng ñối chứng Listeria monocytogenes và chủng
Listeria innocua thành hình vuông góc nhưng không chạm vào nhau. Ủ ñĩa ở 370C trong 20-36 giờ. Phản ứng dương tính khi xuất hiện vùng cộng hưởng tan huyết ngay tại ranh giới của chủng kiểm nghiệm với
Staphylococcus aureus hoặc giữa chủng thử nghiệm với Rhodococus equi. Phản ứng CAMP dương tính với Rhodococus equi sẽ tạo vùng tan huyết rộng (5-10mm) và có hình dạng ñầu mũi tên. Phản ứng dương tính với Staphylococcus aureus thường tạo vùng tan huyết hẹp ( khoảng 2 mm) có dạng hình tròn. Listeria monocytogenes cho phản ứng CAMP dương với S.aureus và âm với Rhodococus equi. Ngược lại, Listeria innocua có phản ứng CAMP âm với cả hai loài Staphylococcus aureus
và Rhodococus equi. 3.2. Phương pháp hiện ñại. 3.2.1. Phương pháp ELISA. 3.2.1.1. Nguyên tắc. - Nguyên tắc của phương pháp miễn dịch là phản ứng giữa một tế bào(kháng nguyên) vớimột kháng thểñặc hiệu. Tín hiệu của một phản ứng miễn dịh có thể nhận biết thông qua sự ngưng tủa hay kết dính của kháng nguyên kháng thể hoặc bằng cách sử dụng những kháng thể ñã ñược ñánh dấu bằng cách nhuộm hùynh quang, ñồng vị phóng xạ, hay enzyme.
- Phương pháp ELISA là phương pháp hấp thụ miễn dịch liên kết enyme. Nguyên tắc kỹ thuật Elisa là sử dụng kháng thể ñơn dòng hay còn gọi là kháng thể sơ cấp phủ bên ngòai những giếng nhỏ nhằm mục ñích thu giữ ñược phép thu giữ bằng cách sử dụng kháng thể thứ 2 có gắn enzyme phát tín hiệu. Khi cho vào hỗn hợp phản ứng một cơ chất ñặc hiệu của enzyme,
phản ứng xãy ra và làm ñổi màu các sản phẩm làm ñổi màu phản ứng.Vì vậy chúng ta có thể phát hiện ñược sự hiện diện của kháng nguyên.
3.2.1.2. Quy trình thực hiện phân tích.
Sơñồ 3.2. Quy trình phát hiện Listeria monocytogenes. Thuyết minh quy trình.
Chuẩn bị mẫu.
Tăng sinh lần ñầu : Thêm 25g mẫu vào 225ml dung dịch 3M Listeria Broth (LB), trộn ñều, ủở 36=5-370C/24h. Cho mẫu vào giếng ñể 30 phút, ở 35-370C Thêm phức hợp kháng thể và enzyme Chuẩn bị mẫu ( tăng sinh lần 1 ở 30- 350C/24h, tăng sinh lần 2 ở 300C/22-24h. Thêm cơ chất, dể khỏang 10 phút ở 20-250C ðọc kết quả
Tăng sinh lần 2: Chuyển 0.1ml dung dịch tăng sinh lần 1 vào 9.9ml canh FRASER ủở 300C/22-24h.
Cách tiến hành phân tích bằng phản ứng ELISA.
Chuẩn bị: Xử lý nhiệt.
Chuyển 1ml mẫu từ canh Fraser vào 50µl dung dịch phụ trợ mẫu vào
ống ñã ñược dán nhãn, ngâm 15 phút trong nước sôi, ñể nguội. Mở
hộpp Listeria VIA và ñể ở nhiệt ñộ phòng. Mở bao và tháo giếng ra rồi
ñặt ở chân ñế.
Cách tiến hành:
Bước 1:
♦ Cấy mẫu và mẫu ñối chứng, ghi lại vị trí cấy mẫu và dung pipep hút 200µlmẫu và dịch ñối chứng vào giếng rồi rữa và ñổ bỏ nước mỗi giếng 3 lần.
Bước 2:
♦ Thêm 200µl chất kết hợp vào mỗi giếng, ñậy giếng, ủ ở 35-370C/30 phút.
♦ Rửa: ñổ hết dung dịch trong giếng rồi rữa và ñổ bỏ nước ở giếng rữa mỗi giếng 4 làn.
Bước 3:
♦ Thêm 200µl cơ chất vào mỗi giếng, ủ 20-250C/15 phút. Them 20µl dung dịch kết thúc giúp ổn ñịnh màu vào mỗi giếng ( nếu cần).
Bước 4: ðọc kết quả.
♦ ðọc bằng mắt thường nhờ bảng so màu hoặc sử dụng máy ñọc.
♦ Nếu mẫu có màu xanh lá cây ñến xanh dương ñậm thì mẫu dương tính.
3.2.2.1.Nguyên tắc.
- Phương pháp sử dụng mẫu dò ñể phát hiện v sinh vật trong thực phẩm
ñược dựa trên sự phát hiện một ñọan gene ñặc trưng của vi sinh vật. Cơ sở
của vịec mẫu dò là quá trình lai phân tử.
- Cơ sở của việc sử dụng mẫu dò là phương pháp lai phân tử. Qúa trình này bao gồm sự tách rời hai mạch ñôi của chuỗi xoắn kép DNA và sự tái bắt cặp các trình tự nucleotide bổ sung khi nhiệt ñộ trở lại bình thường. Sự lai phân tử xãy ra khi ñoạnmồi có trình tự nucleotide bổ sung với một vúng trình tự trên DNA mục tiêu gặp nhau do chuyển ñộng nhiệt và khi nhiệt ñộ
môi trường thấp hơn Tm ít nhất vài ñộ. Qúa trình lai phân tử chịu ảnh hưởng bởi rất nhiều yếu tố: nồng ñộ DNA trong môi trường, nhiệt ñộ và thời gianphản ứng, kích thước các trình tự lai và lực ion của môi trường.
3.2.2.2. Cách làm.
- Hệ thống này sử dụng que với mẫu dò ñể phát hiện Listeria. Mẫu dò là những ñọan Oligomer DNA ñánh dấu bằng hóa chất phát quang. Quy trình có thểñược chia làm 6 bước:
Phát vỡ tế bào thu nhận rRNA.
Mẫu dò DNA có ñuôi oligodeoxyadenylic nucleotide (dA) và mẫu dò phát hiện chứa fluorescenin isothiocynate (F) ở ñầu 5’ và 3’của phân tử ñược
ñặt vào phản ứng.
Que thử ñược bao bọc bởi polydeoxythydien (dT) ñể gắn kết ñược với oligo dA của mẫu dò
Que thử ñược ñặt vào ống ño chứa mẫu dò phát hiện ñược ñánh dấu bằng enzyme.
Sau khi rữa, lọai bỏ phần enzyme thừa , que thử ñược ñặt vào ống ño chứa cơ chất tạo màu.
Sau khi ủñể hiện màu, màu ñược phát hiện ở bước sóng 450nm.
3.2.3.Phương pháp PCR.
3.2.3.1. Nguyên tắc.
- Phương pháp PCR là một phương pháp invitro ñể tổng hợp DNA dựa trên khuôn là môt trình tự DNA ban ñầu, khuyếch ñại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ họat ñộng của enzymepolymerase và môt cặp mồi ñặc hiệu cho ñọan DNA này.
- Toàn bộ quá trình ñược lặp ñi lặp lại 25-30 chu kỳ ñể một bản sao của mẫu DNA có thể biến thành ha2ng tỷ bản sao trong vòng 3-4 giờ.
3.2.3.2. Cách làm.
Cách xác ñịnh Listeria monocytogenes bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi LM-F và LM-R.
- Chủng vi sinh vật: Listeria monocytogenes.
- Chuẩn bị thí nghiệm.
Trình tự gen hlyA ñã ñược công bố trên ngân hàng gen.
Phần mềm BLAST dung ñể xác ñịnh trình tự gen ñích hlyA của Listeria monocytogenes.
Cặp mồi LM-F và LM-R.
Hóa chất sử dụng ñể tách chiết DNA tổng số.
Phương pháp tiến hành thí nghiệm cho phản ứng PCR.
Dựa trên trình tự gen hlyA của các chủng Listeria monocytogennes ñược công bố trên ngân hàng gen, cặp mồi LM-F và LM-R ñược thiết kế bao gồm 20bp/mồi cho sản phẩm PCR 468bp.
- Xác ñịnh tính ñặc hiệu của mồi.
Tính ñặc hiệu của mồi ñược khảo sát bằng cách kiểm tra khả năng bắt cặp của mồi thiết kế với các khuôn DNA của vi khuẩn Listeria moocytogenes và không phải là vi khuẩn Listeria mococytogenes trong phản ứng PCR. - Phản ứng PCR.
DNA khuôn từ Listeria monocytogenes ñược thu nhận cho phản ứng PCR bằng cách tách à làm sạch DNA với chloroform hoặc sử lý nhiệt tế bào ở