4. Sơ lược về cơ chế tác động của chế phẩm Exin R
2.2.1. Phương pháp phân lập nấm bệnh
Các mẫu lúa có các triệu chứng của bệnh khô vằn được thu thập từ những cánh đồng ở đồng bằng sông Cửu Long.
Rửa mẫu sơ qua dưới vòi nước khoảng 2 phút để loại bỏ các tàn dư hữu cơ. Cắt mẫu thành những mảnh nhỏ khoảng 2 – 5mm.
Rửa các mảnh này khoảng 3 lần trong nước cất vô trùng (mỗi lần một phút) và thấm khô bằng khăn giấy vô trùng.
Chuyển các mẫu này lên môi trường nước agar (agar water) 2% có chứa 100μg/ml Streptomycin Sulfate để loại bỏ sự nhiễm khuẩn.
Khi nấm mọc lên thì tiếp tục chuyển sang môi trường PGA (potato glucose agar) để tiếp tục nhân sinh khối của nấm lên.
SVTH: Nguyễn Trí Hiếu 46 2.2.2. Phương pháp tạo giá thể để cấy nấm
2.2.2.1. Vật liệu
- Hạt lúa hoặc hỗn hợp trấu:gạo (1:2). - Bột bắp.
- Túi nhựa chịu nhiệt. 2.2.2.2. Cách tiến hành
Lúa được nấu chín ở 100oC trong khoảng 1 giờ.
Lúa sau khi nấu chín được trộn với bột bắp theo tỷ lệ 2 lúa: 1 bột bắp.
Chuyển hỗn hợp này vào túi nhựa, hấp khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong 15 phút.
Để nguội, sau đó cấy nấm vào giá thể, ủ ở nhiệt độ phòng trong 4 – 5 ngày. Khi thấy sợi nấm mọc đầy giá thể thì đem rải đều xuống ruộng lúa cho nhiễm. 2.2.3. Phương pháp điều tra, đánh giá bệnh trên cây lúa
Điều tra theo dõi bệnh cây nhằm phát hiện và xác định được tình hình phát sinh, mức độ phát triển và đặc điểm biến động của bệnh lúa.
Phương pháp điều tra, đánh giá là đếm tất cả các cây lúa bị bệnh trên tổng số cây trong một lô. Số lượng cây lúa điều tra trên một lô là 420 – 440 cây. Đánh giá sự phát sinh, phát triển, mức độ bệnh bằng các chỉ tiêu: tỷ lệ bệnh, tốc độ tăng trưởng của bệnh theo thời gian (r), hiệu quả phòng trừ bệnh ( Q, %).
SVTH: Nguyễn Trí Hiếu 47 2.2.3.1. Tính tỷ lệ bệnh
Xác định mức độ phổ biến chung của bệnh (tần số thường gặp của bệnh) TLB (%) theo công thức:
Trong đó: A – số lượng cây bị bệnh. B – số lượng cây điều tra. 2.2.3.2. Tính chỉ số bệnh
Để tính chỉ số bệnh cần phải điều tra các cá thể theo bảng phân cấp bệnh quy ước để phân định rõ ràng mức độ bệnh nghiêm trọng khác nhau của chúng.
Tính chỉ số bệnh theo công thức Townsend – Heuberger
Trong đó a – số lượng cá thể bị bệnh ở mỗi cấp. b – trị số cấp bệnh ở mỗi cấp tương ứng.
- tổng số của các tích a.b. (.)abΣ
N – tổng số cá thể điều tra.
T – trị số cấp bệnh cao nhất trong bảng phân cấp bệnh dã dùng (trong trường hợp điều tra về bệnh khô vằn quy ước T = 9).
SVTH: Nguyễn Trí Hiếu 48 2.2.4. Phương pháp phân tích trên phổ hồng ngoại
2.2.4.1. Nguyên tắc
Sự định tính này dựa trên các mũi và sự thể hiện với mật độ ít hay nhiều trên phổ, ta xác định được nhóm chức nào mới xuất hiện.
2.2.4.2. Dụng cụ và hóa chất Dụng cụ Ống nghiệm. Erlen . Cối phá mẫu. Giấy lọc. Ống hút. Hóa chất Cát thạch anh. Chloroform đậm đặc. 2.2.4.3. Tiến hành
Lấy 2 gam mẫu tươi nghiền nhỏ với cát thạch anh, cho thêm 10ml chloroform đậm đặc vào và nghiền tiếp. Tiếp tục lọc dịch chiết qua giấy lọc dưới ống nghiệm.
Đem đi đo phổ ở phòng Phân Tích Hóa Lý ở Viện Khoa Học và Công Nghệ Miền Nam, số 1 Mạc Đĩnh Chi, Quận 1, Tp. Hồ Chí Minh.
SVTH: Nguyễn Trí Hiếu 49 2.2.5. Phương pháp định lượng đường tổng số
2.2.5.1. Nguyên tắc
Sự định phân này căn cứ vào phản ứng đặc trưng của đường và nhiều chất hữu cơ (phenol) với sự hiện diện của H
2SO
4. 2.2.5.2. Dụng cụ và hóa chất
Dụng cụ
Bình định mức 500ml, 100ml, 50ml. Cốc hay bình tam giác 50ml, 100ml. Cối chày sứ. Phễu lọc. Ống nghiệm. Ống hút. Quang phổ kế. Hóa chất Cồn 96 o . Cồn 80 o
(80ml cồn tuyệt đối hòa tan trong 100ml nước). Phenol 5% (5g mới cất hòa trong 100ml nước cất). Dung dịch H
2SO
4 60%.
SVTH: Nguyễn Trí Hiếu 50 - Saccarose 0,1%: 500mg saccarose sấy khô ở 60oC hòa tan trong 500ml nước cất.
- Glucose 0,01%: 0,01mg glucose hòa tan trong 100ml nước cất. - Glucose 0,2mg/ml: 0,1g glucose hòa tan trong 500ml nước cất. 2.2.5.3. Tiến hành
Trích đường
Lấy 1 – 2 gam nguyên liệu tươi đã nghiền nhỏ chứa khoảng 5 – 50mg đường cho vào cốc thủy tinh 50ml và thêm 10ml cồn 96o vào (nếu dùng nguyên liệu khô thì lấy ít mẫu hơn). Sau đó để cốc đun trên nồi cách thủy cho sôi 3 lần.
Khuấy đều bằng đũa thủy tinh. Sau khi để nguội, lọc qua giấy lọc không tro, khi lọc chỉ cần lấy phần rượu.
Sau đó cho tiếp 10ml cồn vào cốc đựng bã, khuấy đều, đun 2 lần tới sôi trong nồi cách thủy. Để nguội lại lọc tiếp tục , chiết rút như vậy khoảng hai lần, xong đưa bã lên lọc và rửa 2 – 3 lần bằng cồn 80o nóng.
Cồn qua lọc cho bay hơi ở trong phòng hay trên nồi cách thủy. Sau khi cho bay hơi cồn thì mẫu có thể để lâu trong bình hút ẩm.
Cặn khô trong cốc được pha loãng với 50ml nước cất. Nếu có cặn thì đễ lắng xuống.
Khi đem làm hiện màu, dung dịch này có thể được pha loãng 5 – 10 lần tùy theo nồng độ cao hay thấp.
SVTH: Nguyễn Trí Hiếu 51 Hút 1ml dung dịch đường có khoảng 10 – 70μg đường cho vào ống nghiệm và thêm vào 1ml dung dịch phenol 5%. Sau đó cho vào ống nghiệm 5ml H
2SO
4 đậm đặc. Tuyệt đối không để dây axit vào thành ống.
Để yên 19 phút rồi lắc và để yên trên bể ổn nhiệt từ 10 – 20 phút ở 25 – 30oC để xuất hiện màu. Màu bền vững trong vài giờ.
Xác định màu trên quang phổ kế ở bước sóng 490nm. Xây dựng đồ thị mẫu
Lấy 7 bình định mức 100 ml rồi cho vào đó theo thứ tự 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7ml dung dich saccarose mẫu 0,1% nói trên, cho nước tới vạch mức. Từ mỗi bình lấy ra 1 ml cho vào ống nghiệm rồi nhuộm bằng phenol và H
2SO
4 như trên.
Mỗi ống nghiệm sẽ chứa tương đương 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70μg saccarose. So màu và vẽ đồ thị mẫu, luôn phải làm kèm với một ống thử trắng bằng 1ml nước cất thay cho dung dịch đường.
Độ chính xác của phương pháp này là ± 0,2%. 2.2.6. Phương pháp định lượng nitơ tổng số
2.2.6.1. Nguyên tắc Dưới tác dụng của H 2SO 4 đặc và các chất xúc tác, tất cả các dạng đạm hữu cơ được chuyển thành NH 4 + . Đẩy NH 4 + bằng dung dịch kiềm và hứng NH
3 thoát ra bằng dung dịch axit. 2.2.6.2. Dụng cụ và hóa chất
SVTH: Nguyễn Trí Hiếu 52 H 3BO 4 4%. HCl 0,25. H 2SO 4 đậm đặc. NaOH 32%. Methyl đỏ. Bromocresol xanh lá. Cồn 96o. Nước cất. Dụng cụ Bộ phá mẫu Kjeldahl. Bếp đun. Cối chày sứ. Bình định mức, bình tam giác, ống hút. Máy cất đạm Parnas Wargner.
2.2.6.3. Tiến hành
Quá trình định lượng Nitơ tổng số được tiến hành theo trình tự 3 bước sau Bước 1: Xác định và phá mẫu
Cân 0,2 gam mẫu đã sấy khô, nghiền kỹ cho vào ống phá mẫu, bổ sung 1 gam chất xúc tác và 5ml dung dịch H
2SO
4 đậm đặc, nối vào bộ thu khí và bắt đầu phá mẫu.
SVTH: Nguyễn Trí Hiếu 53 Khi thời gian phá mẫu kết thúc, đễ ống phá mẫu nguội (khoảng 5 phút), bổ sung 10ml nước cất, trộn đều, để nguội và lắc vào máy chưng cất.
Bước 2: Chưng cất mẫu
Lắp ống phá mẫu vào bộ chưng cất, bổ sung thêm 30ml dung dịch NaOH 32%. Khởi động qui trình chưng cất, dịch chưng cất được thu nhờ bình thu có bổ sung trước axit boric 4% và hỗn hợp chất chỉ thị. Ngừng cất khi thu được khoảng 125 – 150ml dịch chưng cất.
Bước 3: Chuẩn độ
Chuẩn độ bằng HCl 0,25N. Dừng chuẩn độ khi phát hiện màu phớt đỏ. 2.2.6.4. Tính toán
Thông qua số HCl 0,25N; người ta biết được lượng axit boric kết hợp với NH
3
và do vậy biết được số lượng NH
3 giải phóng từ mẫu: trung bình cứ 1ml HCl 0,25N tương ứng với 0,0035g Nitơ hữu cơ. Kết quả tính toán thể hiện theo Nitơ hữu cơ hoặc Nitơ tổng số.
Phần trăm Nitơ tổng (%): thông thường protein chứa khoảng 16% N. Khí NH
3
nhận được khi chưng cất nhân với hệ số qui đổi là 100/16 ≅ 6,25 sẽ cho biết giá trị
protein tương đương ( hay NH
SVTH: Nguyễn Trí Hiếu 54 2.2.7. Phương pháp định lượng phospho tổng số bằng quang phổ kế
Xác định hàm lượng phospho trong giới hạn nồng độ từ 1 – 20mg/cm3. 2.2.7.1. Nguyên tắc
Phương pháp này dựa vào khả năng của ion orthophosphate phản ứng với amonium molybdate tạo thành phosphomolybdate, phức chất có màu xanh lơ.
2MoO 2.4MoO 3 + H 3PO 4 ⎯⎯⎯→ (MoO 2.4MoO 3)2H 3PO 4.4H 2O
Hàm lượng phospho phụ thuộc vào cường độ màu của mẫu đo ở bước sóng hấp thu cực đại 650nm với cuvet có chiều dài 10mm. Dung dịch đối chứng là dung dịch không.
2.2.7.2. Dụng cụ và hóa chất Dụng cụ
Do phương pháp có độ nhạy cao nên các dụng cụ thủy tinh đòi hỏi phải thật sạch.
Bình định mức 50ml, 100ml.
Ống nghiệm có l = 150mm và φ = 15mm. Máy quang phổ kế và cuvet 10mm.
SVTH: Nguyễn Trí Hiếu 55 Hóa chất
Tất cả các hóa chất sử dụng trong thử nghiệm này phải đạt độ tinh khiết phân tích.
Nước sử dụng phải là nước cất hai lần. HCl đậm đặc. HNO 3 đậm đặc. Amoni molybdate. Hydroquinone [C 6H 4(OH) 2], pha khi sử dụng. Kali dihydrophosphate (KH 2PO 4). Sodium sunphic (Na
2SO
3). 2.2.7.3. Tiến hành
Lấy mẫu thử và chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 4325-86. Nếu mẫu khô không khí, xử lý sơ bộ và bảo quản.
Nếu mẫu tươi, xử lý sơ bộ, cô cạn , sấy ở 60oC, sấy ở 105oC, nghiền lấy mẫu trung bình.
Chuẩn bị dung dịch thuốc thử
Dung dịch 1: dung dịch chuẩn gốc (chứa 100μg phospho/ml). Hòa tan 1,4394 gam KH
2PO
4 trong bình định mức 1000ml bằng nước cất và định mức đúng 1000 ml. Chuẩn bị dung dịch chuẩn để lập thang chuẩn (chứa 25μg phospho/ml). Lấy 25ml dung dịch cho vào bình định mức 100ml và định mức bằng nước cất đúng 100ml, ta có dung dịch 1A.
SVTH: Nguyễn Trí Hiếu 56 Dung dịch HCl 10%: 250ml HCl đậm đặc cộng với 750ml nước cất.
Dung dịch 2: Dung dịch Na
2SO
3 20%: cân 20 gam Na
2SO
3 hòa vào trong 100ml nước cất. Dung dịch chuẩn bị khi sử dụng.
Dung dịch 3: dung dịch hydroquinone 0,5%. Hòa tan 0,5 gam hydroquinone trong một ít nước và 3 giọt H
2SO
3, thêm tiếp nước cho đủ 100ml. Dung dịch chuẩn bi khi sử dụng.
Dung dịch 4: Thuốc thử Briggs hay dung dịch amoni molybdate 5%. Hòa tan 50 gam amoni molybdate trong 100ml nước cất. Cho 150ml H
2SO
4 đậm đặc vào trong 400ml nước. Để nguội thêm tiếp dung dịch amoni molybdate 5% đã chuẩn bị vào hỗn hợp, để nguội thêm nước cho đủ 1000ml.
Hỗn hợp thuốc thử: trộn các dung dịch 2, 3, 4 theo tỷ lệ 1:1:1. Chuẩn bị dung dịch tro phân tích
Cân chính xác 1 – 5 gam mẫu (tùy theo mẫu có phospho nhiều hay ít). Vô cơ mẫu ở 550
o
C trong 4 giờ. Để nguội. Thấm ướt tro bằng vài giọt nước cất và thêm 10ml dung dịch HCl 10% và 0,5ml HNO
3 đậm đặc.
Đun nhẹ trong 5 phút (đến khi thấy bay hơi), để nguội đến nhiệt độ phòng. Rửa sạch chén nung và định mức thể tích dung dịch tro đến 250ml bằng nước cất.
Phản ứng lên màu
4. Lấy 10ml dung dịch tro cho vào bình hình nón dung tích 100ml, định mức cho đủ 100ml ta có dung dịch thứ 2.
SVTH: Nguyễn Trí Hiếu 57 6. Thêm 3ml hỗn hợp thuốc thử + nước cất cho đủ 10ml. Trộn đều hỗn hợp, để 30 phút. Đo ở bước sóng 650nm.
Tiến hành dựng đồ thị đường chuẩn
Nồng độ phosphor a dịch thử được ước tính theo phương trình: X (mgP) = (Abs * 0.0057)/ 0.0109
Abs : là giá trị mật độ quang của dịch thử đo ở bước sóng 650nm 2.2. 7. 4 Tính toán kết quả
Trong đó:
X: số μg P có trong dịch thử. V
ddtro: thể tích dung dịch sau khi tro hóa. m: khối lượng mẫu thử (g).
106 : hệ số chuyển đổi từ g sang μg. V : thể tích thử.
Sai số giữa hai lần phân tích song song với độ tin cậy p = 0.95 không vượt quá d =28 ( 0.05 + 0.031X)%.
2.2.8. Phương pháp định lượng kali tổng số 2.2.8.1. Nguyên tắc
SVTH: Nguyễn Trí Hiếu 58 Dung dịch acid percloric (HClO
4) làm trầm hiện Kalium dưới dạng perclorat. Kết tinh lại để loại chất bẩn. Sấy khô và cân trọng lượng KClO
4, từ đó suy ra hàm lượng Kalium. 2.2.8.2. Dụng cụ và hoá chất Dụng cụ Chén sứ nung. Bếp đun cách thủy. Bình định mức 250ml. Phễu lọc Bucher. Ống hút 1ml, 3ml, 5ml. Tủ say, bếp cách cát. Cân phân tích đến 0.0001g. Hóa chất HCl đậm đặc. HClO 4 tinh khiết. Heliantin. Dung dịch BaCl
2 25%: Cho 250 gam BaCl
2 vào bình định mức 1000ml sau đó cho nước vào đến vạch định mức để hoà tan.
SVTH: Nguyễn Trí Hiếu 59 Dung dịch cồn 96o chứa 10ml HClO
4 trong 1000ml cồn. Cồn 96o.
2.2.8.3. Tiến hành: • Công phá mẫu
Cân 0.2g mẫu đã sấy khô hoàn toàn, cho vào bình Kjeldahl, thêm 3-4ml dung dịch H
2SO
4 đậm đặc sao cho vừa ngập mẫu. Ngâm mẫu trong acid qua vài giờ (khoảng 4 giờ). Trong quá trình vô cơ hóa, các nguyên tố khoáng biến đổi dần thành các dạng oxid. Sau đó thêm vào bình vài giọt H
2O
2. đặt bình trên bếp điện, đun nóng từ từ, tránh bếp nóng đỏ làm nguyên liệu bắn lên thành bình và bị bắn ra ngoài(có thể đặt bình trên lưới amiant). Khoảng 30 phút sau, tắt bếp, để nguội và cho thêm vài giọt H
2O
2, rồi đun tiếp. Lần này dung dịch chuyển sang màu cánh gián, đun trong 30 phút, để nguội, cho thêm khoảng 5 giọt H
2O
2 nữa rồi tiếp tục đun cho đến khi dung dịch trắng hẳn.
• Định lượng Kalium
Cho vài giọt HCl đậm đặc vào chất cặn còn lại từ dịch vô cơ hoá. Cho bốc hơi trên nồi chưng cách thủy. Lập lại thao tác như trên lần thứ 2. đun sôi chất cặn còn lại ở 110 – 120oC trong 30 phút để làm silice hoàn toàn không hoà tan, cho 1 giọt HCl đậm đặc vào cặn, thêm nước sôi và cho qua lọc, hứng dung dịch qua lọc trong một bình định mức 250ml, rửa giấy lọc với nước nóng, để nguội dung dịch rồi thêm nước tới vạch.
SVTH: Nguyễn Trí Hiếu 60 Hút 20ml (V’) dung dịch này cho vào bình tam giác, acid hoá bởi HCl đậm đặc với sự hiện diện của 1 giọt Heliantin. Để đun sôi và làm tủa ion SO
4 2-
bởi dung dịch BaCl
2, ta thêm từng giọt BaCl
2 vào, để tủa lắng xuống sau mỗi lần thêm. Sau một giọt BaCl
2 không cho tủa nữa, để yên, lọc và rửa tủa BaSO
4 cẩn thận với nước sôi. Làm bốc hơi dung dịch qua lọc và nước rửa đựng trong bát sứ có mỏ ở nồi chưng cách thủy cho đến khi thể tích còn khoảng 20ml. Thêm vào 2ml HClO
4 đậm đặc và tiếp tục cho bốc hơi đến khi chất cặn gần như khô. Thêm vào 15ml nước cất nóng, 1ml HClO
4 và cho bốc hơi trên nồi chưng cách thủy lần thứ 2 cho đến khi đặc lại. Lúc bấy giờ đun trên nồi đun cát cho đến khi không còn mùi HCl và có khói trắng nhưng tránh đừng để khô.
Để nguội lại, thêm 15ml cồn 96
o
có chứa 0,2% HClO
4 và khuấy với đũa khuấy có đầu bằng. Để yên cho tủa lắng xuống và gạn phần lỏng ở trên qua phễu buchner hay phễu lọc thủy tinh có màng xốp. Rửa như vậy 2 – 3 lần, mỗi lần 2 – 3 giọt alcol percloric nhưng cẩn thận không để tủa qua lọc.
Chất tủa KClO
4 ít nhiều có lẫn trong muối khác. Người ta làm tinh khiết bởi sự kết tinh lại. Đun bát sứ ở nồi chưng cách thủy để loại alcol, hòa tan những tinh thể