4.1.3.1. Tách DNA tổng số, PCR kiểm tra sự có mặt của gen biểu hiện
Các dòng thuốc lá chuyển gen sau thời gian phát triển 30 ngày ở điều kiện invitro, tiến hành chọn lọc từ 30 dòng thuốc lá chuyển gen, lấy 10 dòng và được đánh số ngẫu nhiên từ E1 – E10, tiến hành tách DNA tổng số sau đó PCR với cặp mồi đặc hiệu EPSPS-F/CYMC-R với 10 dòng thuốc lá này.
4.16 10/30 a .
- - 1-E10
Hình 4.16 là kết quả PCR bằng cặp mồi đặc hiệu EPSPS-F/CYMC-R với DNA từ 10 dòng cây sau khi chuyển gen chọn ngẫu nhiên E1-E10, chúng tôi chọn được 8 dòng có kết quả dương tính, sản phẩm PCR cho một băng DNA có kích thước khoảng 1400bp, tương đương kích thước của cấu trúc gen chuyển khi PCR với cặp mồi đặc hiệu. Sản phẩm này không xuất hiện ở cây đối chứng không chuyển gen. Trong tổng số 30 dòng thuốc lá sau khi chuyển gen, kiểm tra bằng phản ứng PCR thu được 20 dòng mang cấu trúc gen cần chuyển. Như vậy có thể khẳng định rằng đã thu được các dòng cây thuốc lá mang cấu trúc gen SP-EPSPS-Cmyc.
4.1.3.2. Kết quả lai Western blot.
Để khẳng định các vector thiết kế và cây mang gen chuyển có khả năng biểu hiện protein đích, chúng tôi đã tiến hành lai Western. Trong thí nghiệm
M - 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1,5 kb 1 kb
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ này, 4 dòng thuốc lá chuyển gen ở thế hệ T0 có kết quả PCR dương tính được lựa chọn để tiến hành phân tích. Cây T0 được lấy mẫu và tiến hành kiểm tra khả năng biểu hiện của protein SP-EPSPS-Cmyc bằng lai Western với kháng thể kháng Cmyc.
Hình 4.17 : Kết quả lai Western blot MK: Maker
WT: cây không mang gen.
1 – 4: 4 dòng thuốc lá chuyển gen
Từ kết quả lai ở hình 4.17 cho thấy 4 dòng cây chuyển gen xuất hiện một băng đặc hiệu có kích thước gần bằng 50kDa. Băng protein này không xuất hiện ở cây đối chứng không chuyển gen (WT), theo kết quả tính toán lý thuyết thì băng protein SP-EPSPS-Cmyc có kích thước 48,8 kDa, gần xấp xỉ 50kDa, như vậy băng protein thu được có kích thước khoảng 50kDa chính là đoạn protein SP-EPSPS-Cmyc và có thể khẳng định chúng tôi đã biểu hiện thành công cấu trúc protein SP-EPSPS-Cmyc trong cây mô hình thuốc lá K326.
4.1.3.3. Kết quả kiểm tra mức độ kháng thuốc của thuốc lá mang gen bằng thuốc trừ cỏ glyphosat.
VIFOSATE 240DD (công ty cổ phần thuốc sát trùng Việt Nam) có nồng độ glyphosate khoảng 2,4 g/l. Đây là thuốc trừ cỏ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ nội hấp phổ rộng không chọn lọc có tác dụng diệt trừ các loài cỏ tranh, cỏ lá rộng với hiệu quả diệt trừ cao 12 ngày sau khi phun.
Hình 4.18. Kết quả kiểm tra các dòng thuốc lá mang gen EPSPS kháng glyphosate Các giống thuốc lá trước khi phun (A) và sau khi phun 12 ngày (B) WT: wild type.
các giống thuốc lá mang gen EPSPS: E1, E4, E5, E6
Hình 4.18 cho thấy các dòng thuốc lá có sinh trưởng và phát triển khác nhau sau 12 ngày xử lý thuốc. Cây đối chứng WT không có khă năng kháng thuốc diệt cỏ nên bị chết, lá rủ xuống và chuyển dần sang màu vàng giống với biểu hiện của các giống E5 và E6. Trong tổng số 20 dòng thuốc lá chuyển gen thu được, các dòng E1, E12, E16 có khả năng kháng glyphosate mạnh nhất, cây xanh tốt, sinh trưởng và phát triển bình thường. Các dòng E4, E7, E11, E18 có khả năng kháng thuốc trừ cỏ kém hơn dòng E1 (một số lá bị rủ và vàng) nhưng vẫn sinh trưởng và phát triển bình thường. Các dòng chuyển gen còn lại mặc dù dương tính PCR nhưng khả năng kháng thuốc diệt trừ cỏ giống với hai dòng E5 và E6, và giống cây WT. Khả năng kháng này có thể do vị trí của gen chuyển trong genome dẫn đến mức độ biểu hiện của gen khác nhau.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ