Năm 1983, các nhà khoa học tại Monsanto và Đại học Washington đã phân lập vi khuẩn đất phổ biến, A. tumefaciens chủng CP4, có khả năng chịu
glyphosate vì EPSPS của nó ít chịu ảnh hưởng bởi sự ức chế của thuốc diệt cỏ glyphosate hơn EPSPS tìm thấy trong cây. Đến năm 1986, họ đã thành công đưa gen CP4 EPSPS vào bộ gen của cây trồng và thu được các cây trồng kháng glyphosate.
Các cây trồng được chuyển gen EPSPS đều có chứa cả 2 dạng EPSPS: EPSPS từ chính bản thân cây trồng sẽ chịu sự ức chế bởi glyphosate; EPSPS từ vi khuẩn CP4 biến nạp có tính kháng lại glyphosate. Vì glyphosate không bám kết với EPSPS có nguồn gốc vi khuẩn ở trong cây chuyển gen sẽ tiếp tục sinh tổng hợp các amino acids, trong khi đó dạng enzyme EPSPS của thực vật bị bất hoạt bởi sự ức chế của glyphosate. EPSPS từ A. tumefaciens sp.chủng CP4 đã tỏ ra có hiệu quả và ứng dụng thành công trong các cây trồng chống chịu glyphosate [18, 28].
Việc áp dụng cây trồng chuyển gen trên toàn thế giới đã phát triển nhanh chóng, ấn tượng, đạt 120 triệu ha trong năm 2008 và tiếp tục phát triển với một tốc độ ổn định [36]. Khoảng 80% tổng diện tích dành cho các loại cây trồng đã được trồng với cây trồng kháng thuốc diệt cỏ, hầu như tất cả là cây trồng kháng thuốc diệt cỏ glyphosate (GR). Sự phát triển mạnh mẽ các loại cây trồng GR đã có tác động đáng kể về kinh tế trong nông nghiệp, nó đã thay thế thị trường thuốc diệt cỏ trước đây để tiết kiệm chi phí cho nông dân trong việc quản lý cỏ dại [33, 39]. Hơn nữa, công nghệ cây trồng GR đã làm giảm tác động xấu đến môi trường và sức khỏe [37, 39].
Tính đến năm 2009, sau 13 năm phát triển của cây trồng GR, có năm loại cây trồng GR khác nhau được trồng ở Mỹ. Trong số này, bông GR (Gossypium
hirsutum L.), ngô (Zea mays L.), cải dầu (Brassica napus L. và B. Rapa L.), và
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Bảng 2.2. Thống kê cây trồng chuyển gen được chấp nhận tại Mỹ.
Loại cây trồng Năm đƣợc phê duyệt
Đậu tương 1996
Cải dầu 1996
Bông 1997
Ngô 1998
Củ cải đường* 1999
Cây linh thảo** 2005
* Bị loại bỏ khỏi thị trường sau khi được giới thiệu lần đầu tiên, nhưng được chấp nhận khi giới thiệu lại trong năm 2008.
** Quay trở lại tình trạng không được chấp nhận trong năm 2007 theo lệnh của tòa án.
Đậu tương GR thông qua nhanh chóng ở Mỹ, hiện đang đại diện cho hơn 90% diện tích trồng đậu tương. Tỷ lệ chấp nhận đậu tương GR ở Argentina thậm chí còn nhanh hơn, đạt gần 90% trong vòng bốn năm sau khi được giới thiệu [26]. Sau khi được sự chấp thuận của chính phủ, các giống đậu tương GR cũng đã được phát triển nhanh chóng ở các bộ phận khác của Nam Mỹ như Brazil.
Ngô GR không phát triển tốt như hiện có với các phương pháp quản lý cỏ dại khi được giới thiệu lần đầu tiên, nhưng sau khi được thông qua tại Mỹ, đã tăng lên nhanh chóng và hiện nay gần như bằng bông.
Khoảng 70% cải dầu trồng ở Canada là GR, và tại Mỹ 62% là GR và 31% kháng glufosinate. Lệnh cấm trồng củ cải đường GR (Beta vulgaris L.) đã được bãi bỏ vào năm 1999, nhưng không được trồng trở lại do sự lo ngại về việc ảnh hưởng tới ngành công nghiệp sản xuất bánh kẹo. Sau đó được giới thiệu lại vào năm 2008 và phát triển với một tốc độ chưa từng có sau khi được thông qua, khoảng 60% cho năm đầu tiên, 95% dự kiến trong năm [26].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Tính kinh tế của cây trồng kháng thuốc diệt cỏ (HRCs) cho các ngành công nghiệp công nghệ sinh học rất hấp dẫn. HRCs cung cấp một nguồn thu nhập từ chi phí hạt giống và thuốc diệt cỏ. Đây là hình thức thu lợi nhuận kép từ hạt giống và hóa chất mà giá trị gen phụ thuộc mang lại.
Nông dân đã nhanh chóng sử dụng cây trồng công nghệ kháng glyphosate với ba lý do chính: tiết kiệm chi phí, quản lý cỏ dại tốt hơn, và đơn giản trong sử dụng. Kể từ khi thông qua các loại cây trồng GR và glyphosate, cây kháng thuốc diệt cỏ đã được kiểm soát bằng cách sử dụng riêng glyphosate, do đó giảm đáng kể chi phí (không có thêm thuốc diệt cỏ). Sau khi mất quyền bằng sáng chế vào năm 2000, giá thành của thuốc diệt cỏ glyphosate đã giảm đáng kể do có nhiều nhà sản xuất trên khắp thế giới, điều đó vô tình đã đẩy giá của thuốc diệt cỏ glyphosate xuống thấp hơn. Gián tiếp làm giảm chi phí để quản lý cỏ dại cho người nông dân.
Tuy nhiên hiện nay vấn đề kinh tế khi sử dụng cây trồng kháng glyphosate đang bị ảnh hưởng bởi sự phát triển của các loại cỏ dại có đặc tính kháng glyphosate đang ngày càng phát triển.
Glyphosate là loại thuốc diệt cỏ không chọn lọc, hầu như tất cả các loài cỏ dại đều có thể được kiểm soát bằng loại thuốc diệt cỏ này, việc cỏ dại tăng trưởng lại hiếm khi xảy ra. Do đó khi giới thiệu phương pháp kết hợp thuốc diệt cỏ glyphosate với cây trồng kháng glyphosate đã cho thấy hiệu quả là rất khả quan, kinh tế, và linh hoạt. Là phương pháp loại bỏ được sự kết hợp giữa các loại thuốc diệt cỏ khác nhau, các loại thuốc chọn lọc cỏ dại và linh hoạt giữa các khu vực khác nhau trong một diện tích trang trại lớn. Sự linh hoạt của phương pháp này chính là lý do quan trọng nhất trong việc chấp nhận cây chuyển gen kháng glyphosate.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu
3.1.1. Thực vật
Giống thuốc lá K326 đang nuôi cấy trong điều kiện invitro do Phòng
Công nghệ tế bào Thực Vật – Viện Công nghệ sinh học cung cấp.
3.1.2. Chủng vi khuẩn
- Chủng vi khuẩn E. coli DH5α (Invitrogen) do Phòng Công nghệ Tế bào Thực Vật – Viện Công nghệ sinh học cung cấp.
- Chủng A. tumefaciens CV58 Phòng Công nghệ Tế bào Thực Vật – Viện Công nghệ sinh học cung cấp.
3.1.3. Các vector
- Vector chuyển gen pBI121 do phòng Công nghệ Tế bào Thực vật – Viện Công nghệ sinh học cung cấp.
Hình 3.1. Sơ đồ vector pBI121
3.1.4. Hóa chất
Các môi trường nuôi cấy:
- Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: LB (đặc, lỏng)
- Môi trường nuôi cấy thực vật: MS (MS + IBA, MS + BAP) (Phụ lục: 1)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Một số hóa chất khác: Kit tinh sạch DNA -AccuPrep®
Gel Purification Kit, Gateway® LR ClonaseTM II, thang DNA 1kb và các loại enzyme giới hạn
NcoI, NotI, HindIII. Các hóa chất được cung cấp bởi các hãng: New England
Biolabs (Anh), Amersham Pharmacia Biotech (Thụy Điển), Chemicals (Đức), Sigma (Mỹ), Duchefa (Hà Lan), Invitrogen (Mỹ).
3.1.5. Máy móc và thiết bị
- Máy quang phổ UVvis Cintra 40 (Australia)
- Bộ nguồn điện di PowerPac 300 (Bio-Rad, Hoa Kỳ)
- Máy phân tích axit amin tự động - HP amino Quan SeriesII (Hewlett Parkard, Hoa Kỳ)
- Máy PCR PTC - 100TM (MJ Research, Hoa Kỳ)
- Máy soi ADN (Mini - transllumminator. Bio-Rad, Hoa Kỳ) - Máy li tâm lạnh Hittich (Đức)
- Máy li tâm Avanti TM30 (Backman, Hoa Kỳ) - Máy ly tâm Eppendorf 5415C (Eppendorf, Đức) - Máy khuấy trộn (Voltex) (Minishaker, IKA, Đức), - Máy hút chân không SpeedVac 110A (Savant, Hoa Kỳ)
- Lò vi sóng (SamSung, Hàn Quốc), tủ sấy của hãng Carbolite (Anh), tủ lạnh -200
(Sanyo, Nhật Bản), pipetman, giá đổ điện di, cối chày sứ, bể ổn nhiệt, nồi khử trùng…
Đây là các thiết bị của phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học.
3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.2.1. Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc SP-EPSPS-Cmyc.
3.2.1.1 Xác định và sửa đổi trình tự gen EPSPS
Từ trình tự gen EPSPS của Agrobacterium chủng CP4 trên ngân hàng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ EPSPS. Trên cơ sở trình tự này một trình tự gen có khả năng biểu hiện phù hợp trong hệ thống thực vật được suy diễn bằng phần mềm của công ty Epochlifescience (Mỹ). Để trình tự thu được có độ chính xác cao chúng tôi đã tổng hợp nó tại hãng.
3.2.1.2. Phản ứng cắt đoạn gen SP-EPSPS-Cmyc từ vector pBluescript.
Để thiết kế vector chuyển gen, plasmid pBluescriptII SK(-)/EPSPS và vector chuyển gen pBI121 được cắt đồng thời bằng 2 enzyme XbaI/SacI.
Phản ứng được ủ ở 370 C trong vòng 6h. Bảng 3.1.Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme giới hạn STT Thành phần Thể tích (µl) 1 H2O deion 20,5 µl 2 Buffer Tango(10X) 5 µl 3 SP-EPSPS-Cmyc (50ng/µl) 20 µl
4 Enzyme Xbal (10u/µl) Enzyme Sac I (10u/µl)
2 µl 2,5 µl
3.2.1.3. Phương pháp thôi gel
Sản phẩm cắt SP-EPSPS-Cmyc bằng enzym giới hạn từ vector tạo dòng pBluescriptII SK(-)/EPSPS được tinh sạch để chuẩn bị lai tách dòng.
Quá trình thôi gel, tinh sạch được thực hiện theo quy trình và bộ hóa chất sử dụng cho tinh sạch của hãng QIAGEN (QIAquick DNA Gel Extraction Kit), gồm các bước sau:
- Thêm Buiding buffer và sản phẩm PCR tỉ lệ 1: 1, ủ 550C/10 phút. - Chuyển sang cột lọc tím li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút 30 giây. - Bổ sung Wash buffer li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút 30 giây. - Chuyển cột lọc tím sang ống eppendorf 1,5 ml mở nắp 5 phút.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ - Bổ sung nước khử ion để 5 phút li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút
30 giây thu dịch đáy bảo quản ở -200 C.
3.2.1.4. Ghép nối đoạn gen SP-EPSPS-Cmyc vào vector pBI121
Sản phẩm cắt SP-EPSPS-Cmyc từ vector plasmid pBluescript và vector pBI121 bằng 2 enzyme XbaI/SacI, được tinh sạch sau đó được ghép nối bằng T4 ligase tạo plasmid tái tổ hợp mang gen CP-EPSPS-Cmyc.
Bảng 3.2. Thành phần phản ứng lai STT Thành phần Thể tích (µl) 1 H2O deion 1 2 Buffer T4 ligase 10X 1 3 pBI121 (500 ng/µl) 4 4 CP-EPSPS-Cmyc (500 ng/µl) 3
5 Enzyme T4 ligase (10u/µl) 1
Tổng thể tích 10
Hỗn hợp phản ứng được ủ ở nhiệt độ 220
C trong 2 giờ.
Đặt phản ứng trong đá và chuẩn bị thực hiện quá trình biến nạp vào tế bào khả biến E. Coli DH5α.
3.2.1.4. Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào E. Coli DH5α Nguyên lý
Dưới tác dụng của CaCl2 thành của tế bào vi khuẩn đang ở thời kỳ sinh trưởng sẽ trở nên xốp. Khi đó việc thay đổi nhiệt độ thích hợp sẽ làm xuất hiện các lỗ tạm thời trên màng tế bào, tạo điều kiện cho các phân tử DNA đi vào tế bào chất.
Phương pháp chuẩn bị tế bào khả biến E. Coli DH5α.
- Tế bào E.coli DH5α được cấy ria trên môi trường LB đặc và nuôi qua đêm ở 370
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ - Cấy 1 khuẩn lạc E.coli vào môi trường LB lỏng lắc 200 vòng/ phút, ở
37oC, qua đêm.
- Chuyển 0,5 ml dịch tế bào sang 50 ml môi trường LB, tiếp tục nuôi lắc 200 vòng/ phút, ở 37oC cho tới khi OD600 đạt 0,4 - 0.6. Sau đó, lấy mẫu ra và đặt vào đá khoảng 1h. Từ bước này tất cả các thao tác đều phải được tiến hành ở 4o
C.
- Ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút, thu tế bào. Hòa tế bào bằng 50 ml nước khử ion, lạnh vô trùng. Ly tâm 4000 vòng/ phút, thu tủa.
- Hòa tế bào thu được trong 50ml CaCl2 100 mM (lạnh, vô trùng). Ủ mẫu 15 phút và ly tâm thu tế bào ở 4000 vòng/phút trong 10 phút.
- Hòa tủa trong 25 ml CaCl2 100 mM, ủ mẫu 60 phút trong đá. - Ly tâm 4000 vòng/ phút trong 10 phút ở 4oC.
- Hòa tế bào trong 0,5 ml CaCl2 100 mM, bổ sung glycerol 15% trộn đều.
- Hút 0,1ml dịch tế bào trên vào mỗi ống eppendorf và bảo quản ở -80oC.
Biến nạp bằng sốc nhiệt
- Tế bào khả biến được lấy từ -80oC, làm tan dần trong đá trong khoảng 30 phút.
- Lấy 7 µl mẫu sản phẩm lai, đảo nhẹ nhàng để DNA phân bố đều trong dịch tế bào khả biến. Sau đó để mẫu trong đá 30 phút.
- Sốc nhiệt bằng cách chuyển mẫu vào bể ổn nhiệt với nhiệt độ là 42o C và ủ trong 90 giây.
- Lấy mẫu ra rồi đặt ngay vào đá trong 2 phút.
- Bổ sung khoảng 500 - 600 µl LB lỏng vào mẫu lắc ở 37o
C trong 45 – 50 phút.
- Ly tâm 5.000 vòng ở 250C trong 5 phút, loại bỏ gần hết dịch nổi, chỉ để lại khoảng 100µl dịch, trộn đều sinh khối lắng để thành dạng huyền phù tế bào.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ - Hút 100 µl dịch tế bào và cấy trải trên đĩa môi trường LB đặc bổ sung
kanamycine 50mg/l. - Nuôi qua đêm ở 37o
C.
3.2.1.5. Phương pháp tách chiết plasmid
Vector tái tổ hợp được tách chiết theo phương pháp tách chiết plasmid của Sambrook và Russell (2001)[31].
Bảng 3.3. Thành phần hóa chất tách chiết plasmid
STT Thành phần
Sol I 50 mM glucose, 25 mM Tris HCl pH 8, 10 mM EDTA pH 8
Sol II 0,2 NaOH, SDS 1 %
Sol III 60 ml potassium acetate 5M; 11,5 ml glacial acetic acid; 28,5 ml H2O
Các bước tiến hành tách plasmid:
- Lấy 10 ml dung dịch vi khuẩn nuôi trong LB lỏng 12 - 16 giờ. - Ly tâm 8000 v/p thu tế bào, có thể lặp lại 5 lần để thu hết cặn khuẩn
của 10 ml dịch khuẩn.
- Bổ sung 200 µl Sol I hòa tan tế bào hoàn toàn. - Bổ sung 400 µl Sol II trọn nhẹ trong 30 giây. - Bổ sung tiếp 300 µl Sol III trộn nhẹ trong 30 giây.
- Bổ sung 900 µl chloroform : isoamin (24 : 1) trộn đều trong 3 phút. - Ly tâm 13000v/p, hút nhẹ nhàng không cặn 900µl pha trên sang ống
effendorf mới.
- Cho 900 µl isopropanol 100% để ở nhiệt độ -4o
C trong 30 – 180 phút, ly tâm 13000 v/p, loại bỏ phần dịch lỏng, thu cặn.
- Cho 500 µl cồn 70% vào, ly tâm 7000 v/p trong 5 phút, sau đó loại bỏ cồn và làm đông khô trong 30 phút.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ - Hòa tan sản phẩm trong 50 µl nước khử ion.
- Bổ sung Rnase - Ủ ở 370
C trong 30 phút.
- Kiểm tra sản phẩm tách plasmid bằng điện di trên gel agarose 0,8%. Cắt sản phẩm tách plasmid bằng enzym cắt giới hạn XbaI và SacI, sau đó
sử dụng phương pháp PCR để kiểm tra sự có mặt của gen quan tâm với cặp mồi pUC18- F và pUC18- R với chu kì nhiệt 55o
C, cho phản ứng PCR như sau: Bảng 3.4. Thành phần phản ứng PCR STT Thànhphần Thểtích (µl) 1 H2O deion 12,5 2 Buffer (10x) 2,5 3 dNTPs (25mM) 2,5 4 MgCl2 (2,5 mM) 2,5 5 pBI121/EPSPS (100ng) 2
6 Taq polymerase (1u/µl) 1
7 pUC18- F (10 pM) 1 8 pUC18- R (10 pM) 1 Tổng 25 72oC ∞ 94oC 94oC 4 phút 45 giây 550C 45 giây 1 phút 15 giây 72oC 10 phút 4oC
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ - Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên agaro
1%.
A.tumefaciens CV58
3.2.2.1. Quy trình biến nạp vào A. tumefaciens bằng xung điện:
- Tế bào khả biến A. tumefaciens CV58 được giữ trong tủ -85 o C. - Làm lỏng tế bào khả biến trên đá 30 phút.
- Thêm 5 – 10 µl sản phẩm DNA tái tổ hợp, để trên đá 10 phút.
- Để trên đá 10 phút, cuvet được ngâm cồn, chiếu đèn tím khử trùng rồi làm lạnh trong đá 5 phút, sau đó bổ sung dịch tế bào khả biến chứa vector tái tổ hợp vào trong cuvet.
- Xung điện ở 25F, 2,5kV, 400Ω.