Sau khi biến nạp thành công vector pBI121/EPSPS vào vi khuẩn A. tumefaciens, chúng tôi tiếp tục tiến hành chuyển gen SP-EPSPS-Cmyc
thông qua việc lây nhiễm chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang cấu trúc gen SP-EPSPS-Cmyc vào tế bào của các mảnh lá cây thuốc lá Nicotiana tabacum K326 đã được cắt tổn thương 4 cạnh và nuôi cấy trên môi trường
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 4.11. Mảnh lá cảm ứng trên môi trường GM sau 2 ngày.
Để chuẩn bị cho việc biến nạp chúng tôi đã song song với việc nuôi lỏng A. tumefaciens mang cấu trúc gen SP-EPSPS-Cmyc đồng thời gây tổn thương mảnh lá trước hai ngày. Sau hai ngày khuẩn được nuôi phục hồi trong môi trường LB lỏng không có kháng sinh, sau đó chúng tôi tiến hành đo OD600nm nếu đạt chỉ số từ 0,6 đến 1 thì có thể sử dụng khuẩn để tiến hành biến nạp được.
Sau hai ngày đồng nuôi cấy trong tối, chúng tôi tiến hành rửa khuẩn bằng cefotaxim, cấy chuyển các mảnh lá sang môi trường GM có bổ sung cefotaxim, kanamycin (Hình 4.12)
Hình 4.12. Mảnh lá sau khi đồng nuôi cấy 2 ngày trên môi trường GM.
Sau 2 - 3 tuần xuất hiện các chồi nhỏ (Hình 4.13). Số mảnh lá sống sót trên môi trường chọn lọc bằng kháng sinh là 117/150. Từ các mảnh lá,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ tiến hành tách các chồi nhỏ và cấy lên môi trường MS cơ bản có bổ sung cefotaxim, kanamycin để nhân nhanh chồi.
Hình 4.13. Chồi mọc lên trên môi trường MS + BAP + kanamycin + cefortaxim. Sau 4 - 5 tuần, chúng tôi thu được rất nhiều chồi từ các mảnh lá đã cảm ứng tạo mô sẹo (Hình 4.14), các chồi phát triển cao khoảng 3cm thì được cắt và chuyển sang môi trường RM có bổ sung cefotaxim, kanamycin (Hình 4.15)
Hình 4.14. Các chồi tái sinh chuẩn bị chuyển sang môi trường ra rễ.
Qua 3 lần biến nạp, kết quả thu được số cây ra rễ đã chọn lọc sơ bộ được thể hiện ở Bảng 4.1.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Bảng 4.1. Kết quả tạo cây thuốc lá chuyển gen SP-EPSPS-Cmyc
Biến nạp Tổng mảnh lá Số mảnh lá sống sót sau 3 tuần Số mảnh lá cảm ứng tạo chồi Số cây ra rễ trên môi trƣờng chọn lọc Lần 1 50 40 40 30 Lần 2 50 39 37 32 Lần 3 50 38 31 30 Tổng 150 117 108 92
Bảng 4.1 cho thấy số lượng mảnh lá sống sót trên môi trường chọn lọc giảm dần theo thời gian, điều này cho thấy khả năng những mảnh lá tồn tại và phát triển được là những mô mang các tế bào đã được chuyển gen. Sau 3 - 4 tuần, có 117/150 mảnh lá sống sót trên môi trường chọn lọc qua 3 lần biến nạp. Sau 6 – 8 tuần, 92 cây thuốc lá chuyển gen hoàn chỉnh được tạo thành
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/