Tôm hùm là loại động vật ăn tạp, trong tự nhiên chúng ăn chủ yếu là các loại động vật như: Cá, tôm, cua ghẹ, cầu gai, giáp xác nhỏ, nhuyễn thể,...ngoài ra còn ăn
các loại thực vật như rong rêu., chúng thường có tập tính bắt mồi tích cực vào ban đêm và tờ mờ sáng. Tuỳ vào giai đoạn phát triển mà nhu cầu dinh dưỡng khác nhau, tôm càng nhỏ thì nhu cầu dinh dưỡng càng cao, ở giai đoạn trước lột xác 2-4 ngày tôm ăn rất mạnh, giai đoạn lột xác tôm sẽ ăn chậm lại.
Tôm hùm cũng như nhiều giáp xác khác sinh trưởng thông qua quá trình lột xác. Ở giai đoạn tôm còn nhỏ chu kỳ lột xác ngắn, tôm càng lớn chu kì lột xác càng dài, sau mỗi lần lột xác thì kích thước và khối lượng của tôm tăng lên rất nhiều. Nhìn chung thì tôm hùm có chu kỳ lột xác dài hơn so với các loài giáp xác khác, do vậy tốc độ tăng tưởng của chúng tương đối chậm.
1.2.3 Đặc điểm sinh trƣởng
Sự sinh trưởng ở tôm hùm được xác định bằng sự tăng lên về chiều dài giáp đầu ngực (CL) hoặc khối lượng cơ thể (W) và mức tăng sinh trưởng được thể hiện rõ qua chu ký lột xác, điểm đặc trưng ở lớp giáp xác. Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến chu kỳ lột xác của tôm bao gồm các yếu tố ngoại cảnh lẫn nội tại như: nhiệt độ nước, ánh sáng, các hormone lột xác và ức chế lột xác, thức ăn, tập tính sống, sự tái tạo phần phụ,…
Do ảnh hưởng của nhiệt độ nước làm tăng giảm quá trình trao đổi chất trong cơ thể tôm từ đó hoạt động tích lũy năng lượng cần thiết cho quá trình sinh trưởng của tôm cũng bị thay đổi theo. Khi nhiệt độ nước thay đổi đột ngột 3 – 50
C, tôm con có thể bị chết do không kịp thích nghi. Khi nhiệt độ tăng cao và ổn định (29 – 300
C) thời gian lột xác là 4 – 6 ngày; khi nhiệt độ hạ thấp xuống 20 – 240C, thời gian giữa hai lần lột xác kéo dài gấp 1 – 1,2 lần.
Tôm có kích cỡ càng nhỏ càng nhạy cảm với ánh sáng. Những con nuôi trong điều kiện không có ánh sáng không những bị kéo dài chu kỳ lột xác mà hoạt động bắt mồi cũng bị ảnh hưởng, đặc biệt là mất dần các sắc tố và biến đổi màu tự nhiên của vỏ, làm cho tôm phát triển không bình thường[7].
Nhìn chung, tôm hùm lớn lên nhờ quá trình lột xác. Tôm càng nhỏ, quá trình lột xác càng ngắn và tôm lớn càng nhanh. Tôm hùm có chu kỳ lột xác dài hơn so với các loài giáp xác khác, do đó, tốc độ tăng trưởng của chúng cũng chậm hơn.
Qua mỗi lần lột xác kế tiếp, tỷ lệ phần trăm chiều dài giáp đầu ngực của tôm giảm xuống nhưng độ dài vỏ tôm vẫn tăng nhiều [8].
1.2.4 Đặc điểm sinh sản
Tôm hùm sinh sản rải rác quanh năm nhưng mùa vụ sinh sản của giống Palinurus chủ yếu từ tháng 4-5 và tháng 9 hàng năm. Sức sinh sản của tôm hùm tương đối lớn và chúng có thể đẻ nhiều lần trong một năm (thường là 2 lần/năm). Tôm hùm có kích thước vỏ đầu ngực từ 90 – 99 mm đã bắt đầu tham gia sinh sản.
Đến mùa sinh sản tôm thành thục kết đàn di cư ra các vùng biển sâu 10-35m và có độ mặn 30/340
/00 để đẻ. Tôm thụ tinh ngoài, con đực gửi khối túi tinh trên mảnh ức của con cái. Túi tinh được làm rách nhiều giờ trước khi con cái đẻ để thụ tinh với trứng ở phần bụng và chân bơi. Tôm giữ trứng ở các đôi chân bụng cho đến khi trứng nở. Ấu trùng Phyllosoma qua 12 lần lột xác và biến thái thành ấu trùng Puerulus. Ấu trùng Puerulus qua 4 lần lột xác thành tôm hùm con. Từ lúc trứng nở đến giai đoạn ―tôm trắng‖ kéo dài khoảng 10 – 12 tháng.
1.2.5 Giá trị của tôm hùm
Tôm hùm được tôn vinh là vua của các loại hải sản giá trị dinh dưỡng cao. Thịt tôm hùm chắc, dai, ngọt ăn một lần không thể nào quên. Tập trung sự tinh túy nhất ở con tôm hùm là gạch san đúng nơi đầu tôm và chạy thành dải vàng dọc sống lưng. Gạch tôm hùm béo, thơm, nhiều đạm.
Về chất lượng sản phẩm, theo các tài liệu phân tích, phần ăn được của tôm hùm chiếm 20 – 30% thể trọng. Trong thịt của tôm Hùm tính theo trọng lượng tươi, hàm lượng protein chiếm 17,62%, lipid chiếm 0,29%, các axit amin chiếm 77,2% protein cơ thể. Do thịt thơm ngon giàu chất dinh dưỡng, nên tôm Hùm được coi là món ăn sang trọng quý hiếm và được ưa thích ở nhiều nước. 70% còn lại là vỏ, đầu thân được sử dụng để sản xuất chitosan ứng dụng trong lĩnh vực y dược, thực phẩm, bao gói bảo quản thực phẩm và hóa mỹ phẩm phục vụ nhu cầu của nền kinh tế.
1.3 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của bacteriocin
1.3.1 Ứng dụng
Từ rất lâu các bacteriocin này đã được ứng dụng rộng rãi trong bảo quản thực phẩm, điển hình là Nisin. Năm 1953, thương phẩm Nisaplin xuất hiện trên thị trường như chất bảo quản thực phẩm và đến năm 1969, tổ chức WHO công nhận Nisin là chất bảo quản an toàn có nguồn gốc sinh học. Từ đó, các bacteriocin càng được ứng dụng nhiều trong công nghệ thực phẩm, nhất là trong trong bảo quản thực phẩm như phomat, xúc xích, sữa chua, một số loại sản phẩm thịt, rau quả đóng hộp… để thay thế cho các chất kháng sinh để hạn chế tác dụng phụ của nó, nhờ tính ưu việt của chúng:
- Bacteriocin có tính an toàn cao trong thực phẩm dành cho người. Chúng có ít hạn chế hơn so với những chất bảo quản hóa học vì là các phân tử được sản sinh tự nhiên bởi vi sinh vật lên men trong thực phẩm lên men truyền thống . - Không gây tác động đến môi trường vì chúng bị thoái biến nhanh chóng. - Các bacteriocin được sử dụng như nguồn thức ăn chủ yếu đối với các tác
nhân gây bệnh mà không làm ảnh hưởng đến vi khuẩn có lợi.
- Bacteriocin không làm thay đổi các tính chất cảm quan của thực phẩm. - Chúng có phổ hoạt động rõ ràng.
- Có tác dụng bổ sung cho các tác nhân kháng khuẩn.
Không chỉ vậy, bacteriocin còn được ứng dụng trong chăn nuôi làm thuốc tăng trọng. Trong y dược, thú y, bacteriocin còn được ứng dụng như một chế phẩm
sinh học để điều trị một số bệnh như viêm đường tiết niệu, hay nhiễm trùng đường tiêu hoá…
1.3.2 Tình hình nghiên cứu
Bacteriocin mang lại nhiều lợi ích, và ứng dụng trong cuộc sống nhờ các tính chất đặc trưng của chúng. Song còn nhiều vấn đề liên quan đến bacteriocin chưa được sáng tỏ. Vì vậy, thúc đẩy các nhà khoa học bắt tay vào nghiên cứu lĩnh vực này. Và việc nghiên cứu và phát triển các loài vi sinh vật có khả năng sinh bacteriocin có phổ kháng khuẩn lớn được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực là vấn đề mà nhiều nhà khoa học trong nước và trên thế giới quan tâm. Có rất nhiều công trình nghiên cứu từ trước đến nay đã góp phần nâng cao chất lượng cuộc sống nhân loại.
Vào tháng 1/1999, Budu-Amoako E cùng cộng sự thuộc trung tâm Công nghệ thực phẩm PEI, Canada đã nghiên cứu được hiệu quả kết hợp của Nisin và nhiệt độ trung bình để tăng khả năng tiêu diệt Listeria monocytogenes trong các thùng chứa bảo quản tôm hùm. Theo đó, khi thêm Nisin ở mức 25mg/kg vào thùng chứa tôm hùm có muối bao xung quanh, kết hợp với quá trình xử lý nhiệt 60oC trong 5 phút và 65oC trong 2 phút sẽ giúp giảm đáng kể L.mono.
Năm 2002, Soore cùng cộng sự đã nghiên cứu việc tạo ra một chất kháng khuẩn đặc biệt của vi khuẩn lactic gọi là bacteriocin. Bacteriocin được sử dụng như một chất bảo quản thực phẩm tự nhiên có khả năng thay thế các loại hoá chất bảo quản khác. Bacteriocin có bản chất là protein nên rất an toàn đối với sức khoẻ con người. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Năm 2004, nhóm tác giả Todorov, Van và Dicks thuộc khoa vi sinh, đại học Stellenbosch- Nam Phi đã nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của chủng
Lactobacillus Plantarum ST13BR , một chủng được phân lập từ bia Barley. Bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Lactobacillus plantarum được phân lập từ bia barley (kích thước phân tử 10kDa) ức chế sự phát triển của vi khuẩn
Lactobacillus casein, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Klebsiella pneumoniae và Escherichia coli. Nghiên cứu đã đưa ra được các loại môi trường có
ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp bacteriocin và hỗn hợp các loại môi trường mà việc sinh tổng hợp bacteriocin là lớn nhất.
Năm 2006, 50 chủng vi khuẩn lactic được tìm thấy từ sản phẩm lên men truyền thống suan-tsai của Đài Loan. Với các chủng sau khi phân lập tiếp tục nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá và khả năng sinh tổng hợp bacteriocin.
Năm 2006, Marcinowski, giám đốc điều hành nghiên cứu tại BASF cho biết kẹo cao su có chứa các chủng vi khuẩn có lợi Lactobacillus do công ty hoá chất BASF của Đức phát triển. Đây là sản phẩm giúp người dùng loại trừ các bệnh về răng miệng. Chủng Lactobacillus mới có tên là L anti-caries có khả năng sinh bacteriocin làm cho vi khuẩn gây sâu răng kết thành khối không thẻ dính trên bề mặt răng và bị loại bỏ dễ dàng khi súc miệng.
Tháng 3/2007 nhóm tác giả Todorov và Dicks KM thuộc khoa vi sinh, đại học Stellenbosch- Nam Phi đã nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của chủng Lactobacillus pentosus ST712BZ được phân lập từ boza. Bacteriocin ST712BZ (kích thước 14kDa) ức chế sự phát triển của Lactobacillus casei, E.coli,
Pseudomonas aeruginosa, Enterococus faecalis, Klebsiella pneumoniae và
Lactobacillus curvatus. Sự phát triển của chủng ST712BZ trên môi trường BHI, M17, sữa đậu nành và mật đường tương tự như trên môi trường MRS với việc sinh tổng hợp bacteriocin cực đại (12800AU/ml) được ghi nhận trên môi trường MRS sau 24h. Nghiên cứu đã đưa ra được các loại môi trường, nhiệt độ và pH có ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp bacteriocin và thành phần hỗn hợp các loại môi trường mà việc sinh tổng hợp bacteriocin là lớn nhất.
Các nhà nghiên cứu Csiro để tìm ra một vài bacteriocin và sử dụng chúng để tiêu diệt những con vi khuẩn gây bệnh giống trong gà và lợn. Bộ gen cho phân tử bacteriocin sẽ được chèn vào gen vi khuẩn không gây bệnh hoặc vi rút mà có thể sinh sản và tiết ra bacteriocin. Lợi ích chính của việc sử dụng bacteriocin là nó sẽ giảm mầm bệnh nguy hiểm của con người chống cự lại thuốc kháng sinh.
Các nhà nghiên cứu thuộc Đại học Tổng hợp Klemson vừa phát hiện ra một loại thuốc chống vi khuẩn mới không gây tính lờn thuốc từ chính những vi khuẩn tạo ra loại pho mát Thụy Sĩ. Những vi khuẩn này tiết ra một loại protein có tên bacteriocin, tạo nên tính chất của pho mát. Các thử nghiệm sơ bộ cho thấy chúng có tác dụng chống lại hơn 150 loại vi khuẩn thường gặp.
Năm 2009, pinto và cộng sự đã nghiên cứu mô tả đặc tính chống vi khuẩn
Listeria của bacteriocin phân lập từ động vật có vỏ, kháng sinh tiềm năng kiểm soát chất lượng thủy sản không lên men.
Tháng 11/2009, Satish Kumar R, Arul V thuộc khoa Công nghệ sinh học trường đại học Pondicherry, Ấn Độ đã tách chiết một loại bacteriocin từ chủng Streptococus phocae PI80 phân lập bởi tôm thẻ chân trắng Ấn Độ được đặt tên phocaecin PI80. Chất kháng khuẩn này nhạy cảm với các enzyme: trypsin, proteinase, pepsin, chymotrypsin. Có hoạt động ức chế một số tác nhân gây bệnh quan trọng như: Listeria monocytogenes, Vibrio parahaemolyticus, V.fischeri.
Tháng 2/2011, Ozdemir cùng cộng sự thuộc khoa Công nghệ sinh học, trường đại học Adnan Menderes, Thổ Nhĩ Kỳ đã xây dựng một bộ sưu tập gồm 57 chủng Enterococcal phân lập từ các nguồn gốc khác nhau (bao gồm nước sông, xử lý cây trồng, nước thải, đất, động vật, và các loại rau) được sử dụng để sản xuất bacteriocins. Enterococcin được xác định ở các cấp độ loài như Enterococcus faecium, E. hirae, E. casseliflavus, E. durans, E. faecalis, E. mundtii và E. avium. 40 chủng trong 57 chủng phân lập được có khả năng ức chế sự tăng trưởng của ít nhất một loại vi khuẩn chỉ thị.
Gần đây vào tháng 6/2012, Samar L cùng cộng sự thuộc phòng thí nghiệm ERT 62, trường đại học Biopharma Ambrilia S.A, Pháp đã tìm ra một loại bacteriocin mới lacticin LC14 sản sinh bởi Lactococcus lactis BMG6.14 phân lập từ môi trường nước thịt kết tủa bởi ammonium sulfate. Lacticin LC14 cho thấy hoạt động diệt khuẩn, loại kháng sinh chống lại một số vi khuẩn axit lactic và các chủng gây bệnh bao gồm cả vi khuẩn Listeria monocytogenes. Nó bị bất hoạt bởi proteinase K và E pronase, nhưng kháng papain, lysozyme, lipase và catalase.
Lacticin LC14 có khả năng chịu nhiệt, ổn định trong một phạm vi rộng của độ pH (2-10) rất có khả năng ứng dụng làm probiotic và điều trị bệnh.
Cũng như các nước trên thế giới, các nhà khoa học Việt Nam cũng rất quan tâm đến bacteriocin cũng có nhiều công trình khoa học nghiên cứu trong nhiều lĩnh vực, được quan tâm nhiều nhất vẫn là ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm. Song các công trình nghiên cứu này vẫn còn hạn chế về nhiều mặt.
Năm 2006, Phạm Thùy Linh nghiên cứu khả năng tạo chất diệt khuẩn enterocin P tái tổ hợp nhằm ứng dụng trong bảo quản thực phẩm. Đây là nghiên cứu đầu tiên về tạo bacteriocin tái tổ hợp một cách có hệ thống tại Việt Nam. Sản phẩm của nghiên cứu này là protein HisentP tái tổ hợp có hoạt tính kháng khuẩn và các đặc tính sinh hóa tương đồng với enterocin P tự nhiên, bước đầu đã có khả năng kéo dài thời gian bảo quản thực phẩm và có thể tiếp tục nghiên cứu phát triển làm phụ gia sinh học dùng cho bảo quản.
Năm 2008, Nguyễn Thúy Hương đã nghiên cứu việc cố định tế bào vi khuẩn Lactococcus lactic trên chất mang cellulose vi khuẩn (Bacterial Cellulose - BC) để ứng dụng lên men thu nhận bacteriocin. Kết quả thu được như sau: Hiệu quả sử dụng chế phẩm tế bào vi khuẩn cố định trên BC để lên men thu nhận bacteriocin khá cao, có thể tái sử dụng 9 - 10 lần mà vẫn đảm bảo về mặt thời gian lên men, số lượng và chất lượng bacteriocin so với đối chứng. Kết quả thu được cũng góp phần thăm dò 2 ứng dụng mới của cellulose vi khuẩn (BC): sử dụng BC làm chất mangtrong kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật và sử dụng màng mỏng BC làm màng baothực phẩm.
Các nghiên cứu này đóng góp rất lớn trong việc mở rộng lĩnh vực tìm hiểu về bacteriocin. Trong tương lại, sẽ có nhiều công trình nghiên cứu hơn về bacteriocin để vạch ra một hướng đi mới cho chúng.
Chƣơng II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Nguyên liệu
2.1.2 Mẫu tôm hùm
Mẫu tôm hùm được thu mua ở trại tôm Bình Ba, Khánh Hòa. Tôm hùm sử dụng cho thí nghiệm có kích thước khoảng 27cm, nặng 600g. Mẫu tôm được bảo quản sống đưa về phòng thí nghiệm và tiến hành phân lập vi sinh vật từ máu, nội tạng, và cơ thịt.
2.1.3 Chủng chỉ thị
Các chủng chỉ thị là chủng Bacillus B1.1 đại diện cho nhóm vi khuẩn Gram dương và Vibrio V1.1 đại diện cho nhóm vi khuẩn Gram âm. Các chủng này được lấy từ bộ sưu tập vi sinh vật của phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, trường Đại học Nha Trang.
Các chủng Bacillus B1.1 và Vibrio V1.1 đều được nuôi cấy trên môi trường TSB, pH 7,0 ± 0,2, lắc 180 vòng/phút trong 7 - 8 giờ.
Sau khi nuôi dịch đủ thời gian, hút 100µl dịch vi khuẩn để giữ trong dung dịch glycerol 30%, nhằm mục đích bảo quản để sử dụng trong thời gian dài ở -800C. Trước khi thử đối kháng, chuẩn bị chủng bằng cách lấy ống giống được bảo quản, hút 100µl dịch vi khuẩn đem nuôi cấy ở những điều kiện thích hợp trên môi trường nuôi trong vòng 18-24 giờ.
2.1.4 Môi trƣờng hóa chất và thuốc thử (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.1.4.1 Môi trƣờng phân lập, nuôi cấy vi khuẩn
Môi trƣờng TSB (pH 7,3 ± 0,2; 1,5% NaCl)