Các chủng chỉ thị là chủng Bacillus B1.1 đại diện cho nhóm vi khuẩn Gram dương và Vibrio V1.1 đại diện cho nhóm vi khuẩn Gram âm. Các chủng này được lấy từ bộ sưu tập vi sinh vật của phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, trường Đại học Nha Trang.
Các chủng Bacillus B1.1 và Vibrio V1.1 đều được nuôi cấy trên môi trường TSB, pH 7,0 ± 0,2, lắc 180 vòng/phút trong 7 - 8 giờ.
Sau khi nuôi dịch đủ thời gian, hút 100µl dịch vi khuẩn để giữ trong dung dịch glycerol 30%, nhằm mục đích bảo quản để sử dụng trong thời gian dài ở -800C. Trước khi thử đối kháng, chuẩn bị chủng bằng cách lấy ống giống được bảo quản, hút 100µl dịch vi khuẩn đem nuôi cấy ở những điều kiện thích hợp trên môi trường nuôi trong vòng 18-24 giờ.
2.1.4 Môi trƣờng hóa chất và thuốc thử
2.1.4.1 Môi trƣờng phân lập, nuôi cấy vi khuẩn
Môi trƣờng TSB (pH 7,3 ± 0,2; 1,5% NaCl)
Hòa tan 30g môi trường TSB tổng hợp, bổ sung thêm 10g NaCl (để đạt nồng độ cuối là 1,5%) trong 1000ml nước cất, chuẩn pH = 7, sau đó đem rót môi trường vào các bình tam giác (ống nghiệm), làm nút bông và giấy bạc, hấp khử trùng 1210C trong thời gian 15 phút.
2.1.4.2 Môi trƣờng thử hoạt tính TSA
Môi trường TSA được pha từ môi trường TSB có bổ sung thêm 15g agar và 10g NaCl trong 1000ml. Sau đó đun nóng rồi phân phối vào bình tam giác. Hấp khử trùng 1210C trong thời gian 15 phút. pH cuối 7,3 ± 0,2.
2.1.4.3 Dung dịch nƣớc muối sinh lý
Hòa tan 8,5g NaCl trong 1 lít nước cất. Hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210 C trong 15 phút rồi để nguội.
2.1.4.4 Thuốc nhuộm tím Violet
Hòa tan 1g tím violet vào trong 10ml cồn (dung dịch 1)
Hòa tan 2g phenol tinh thể vào trong 10ml nước cất (dung dịch 2)
Trộn chung dung dịch 1 và dung dịch 2 lại với nhau ta có dung dịch thuốc nhuộm tím violet.
2.1.4.5 Thuốc nhuộm Liugol
Hòa tan iod vào nước cất, sau đó cho KI vào, bảo quản trong lọ tối màu.
2.1.4.6 Thuốc nhuộm Fuschin
Hòa tan Fuschin vào trong 10ml cồn 95% (dung dịch 1). Hòa tan phenol tinh thể vào 100ml nước cất (dung dịch 2).
Trộn đều dung dịch 1 và dung dịch 2 đem lọc, ta có thuốc nhuộm fuschin.
2.1.4.7 Dung dịch xanh methylen
Dung dịch này bao gồm 25g xanh methylen và 300ml rượu ehtylic. Được pha chế như sau:
Hòa tan xanh methylen vào rượu rồi lọc (dung dịch 1). Dịch lọc 1 thêm 1ml KOH 1% và 1000ml nước cất.
2.1.4.8 Thuốc thử Catalase
Dung dịch 30% H2O2 (hydrogen peroxide)
2.1.5 Thiết bị chuyên dụng
- Cân phân tích BL-3200H (L) (Shimadzu, Nhật Bản) - Máy dập mẫu Smasher (Việt Nam)
- Thiết bị ly tâm (Eppendorf Centrifuge 5417R, Mỹ) - Tủ sấy (Binder, Đức)
- Tủ cấy (Telstar AV 100, OSI Co., Ltd, Đài Loan) - Lò vi sóng (LG, Hàn Quốc)
- Máy lắc (GFL 3005, Đức)
- Tủ ấm Binder BF115 (Binder, Đức)
- Nồi hấp khử trùng autoclave (Sturdy industrial Co., Ltd, Đài loan) - Kính hiển vi 3 mắt ngắm có camera và máy tính (Motic BA 300 – Mỹ) - Tủ lạnh (NANO silver, Việt Nam)
2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu
Đề tài sử dụng cách tiếp cận kế thừa và chọn lọc các phương pháp phân lập tuyển chọn các chủng có khả năng sinh bacteriocin, sơ đồ quy trình nghiên cứu dự kiến như sau:
Hình 2.1: Quy trình thực hiện Chọn khuẩn lạc đặc trưng
Cấy phân lập Mẫu tôm
Pha loãng
Nuôi trong môi trường lỏng Đồng nhất mẫu
Dịch huyền phù
Xác định hoạt tính bacteriocin
Xác định đặc điểm, phân loại chủng vi khuẩn sinh
bacteriocin Ly tâm thu dịch
Xác định hoạt tính kháng khuẩn của chủng vi khuẩn
Các mẫu máu, nội tạng, và cơ thịt của tôm hùm được tiến hành phân lập độc lập. Tiến hành đồng nhất mẫu lấy dịch huyền phù để phục vụ cho việc cấy phân lập tạo khuẩn lạc đặc trưng. Sau quá trình tuyển chọn được khuẩn lạc riêng rẽ, vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường lỏng, rồi đem ly tâm thu dịch. Lấy dịch ly tâm đi thực hiện quá trình thử hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn phân lập được với chủng chỉ thị. Khi đã tuyển chọn được chủng vi khuẩn sinh kháng khuẩn, tiếp tục xác định hoạt tính bacteriocin bằng cách sử dụng enzyme proteinase K và trypsin. Sau đó, sử dụng chủng sinh bacteriocin để xác định đặc điểm và phân loại chủng vi khuẩn sinh bacteriocin.
2.2.1 Phƣơng pháp phân lập vi sinh vật
Mục đích của thí nghiệm tạo bộ sưu tập các chủng vi sinh vật có trong mẫu tôm. Thí nghiệm tiến hành như sau:
2.2.1.1 Xử lý mẫu
Mẫu tôm hùm đem cân khối lượng, sau đó thêm vào dung dịch muối sinh lý đã được khử trùng với tỷ lệ 1:9. Chuẩn bị mẫu xong cho vào túi PE, có chứa mẫu và dung dịch nước muối sinh lý, đem đi đồng nhất bằng máy dập mẫu. Thời gian đồng nhất từ 90 – 120 giây. Sau khi đồng nhất, thu được dung dịch huyền phù.
2.2.1.2 Phân lập
Pha loãng mẫu và cấy đĩa
Tiến hành pha loãng dịch huyền phù trên đến nồng độ 10-5 bằng dung dịch muối sinh lý đã được hấp khử trùng. Trình tự thao tác được trình bày qua hình sau:
Hình 2.2: Trình tự pha loãng 9 ml 9 ml 9 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 9 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 10-5 10-4 10-3 10-2 10-1
Trước khi tiến hành, chuẩn bị các ống nghiệm vô trùng, mỗi ống chứa 9ml dung dịch nước muối sinh lý đã hấp khử .
Lấy dịch mẫu từ túi PE, dịch mẫu có nồng độ 10-1, hút 1ml dịch cho vào 9ml muối sinh lý đã hấp khử trùng ở ống nghiệm khác, thu được dịch pha loãng có nồng độ thấp hơn nồng độ ban đầu 10-2, đưa lên máy votex để trộn đều. Tiếp tục làm tương tự, ta có các ống nghiệm có độ pha loãng mẫu là 10-3
, 10-4,10-5. Sau đó chuẩn bị môi trường TSA, hấp khử trùng ở 1210
C, 15 phút. Chờ môi trường nguội, rồi phân phối vào các đĩa petri (đã sấy ở 1600
C trong 90 phút), mỗi đĩa 15-20ml. Dùng pipet man hút 0,1ml dịch đã pha loãng ở các nồng độ cho vào các đĩa thạch đã ghi tên mẫu, nồng độ và ngày phân lập. Dùng que cấy trang đã khử trùng trang đều lên bề mặt thạch cho đến khi thấy mặt thạch khô. Sau đó, lật ngược đĩa lại cất và nuôi cấy mẫu phân lập ở 370
C. Sau 48 giờ vi khuẩn đã phát triển trên đĩa thạch tiến hành quan sát, tách và tạo khuẩn lạc thuần.
Tách và tạo khuẩn lạc thuần
Khi khuẩn lạc xuất hiện, chọn những khuẩn lạc riêng rẽ trên đĩa peptri rồi cấy vào ống nghiệm, mỗi khuẩn lạc cấy vào một ống (kí hiệu đầy đủ), đặt vào tủ ấm 370C. Sau 24 giờ, dùng que cấy ria thu sinh khối khẩn lạc đã chọn, cấy ria trên đĩa thạch cho đến khi tạo các khuẩn lạc thuần, tiến hành cấy ria nhiều lần. Sau khi cấy, nuôi trong tủ ấm 370C trong vòng 24 giờ. Khi tạo được khuẩn lạc thuần nhất và tách rời trên đĩa thạch thì lấy khuẩn lạc này cấy vào ống nghiệm để giữ giống.
Giữ giống và cấy chuyền
Chọn khuẩn lạc riêng rẽ cấy vào ống thạch nghiêng, tiến hành cấy ziczac trên bề mặt thạch nghiêng để được giống thuần. Các chủng vi khuẩn đã được lựa chọn cấy trên môi trường thạch nghiêng TSA, được đặt vào tủ ấm 370C. Sau 10-14 ngày khi vi sinh vật đã phát triển tốt, các ống giống được bảo quản trong tủ lạnh ở 4 – 60C. Sau 2-3 tháng cấy chuyền lại một lần. Để bảo quản được lâu hơn ta có thể giữ giống trong paraffin lỏng vô trùng hay giữ trong glycerol hoặc đông khô.
Nuôi cấy khuẩn lạc thuần trong các bình tam giác chứa môi trường TSB trong 7 – 10 giờ. Chia nhỏ huyền phù tế bào vào từng ống eppendorf 1,5ml, sau đó
thêm vào glycerol theo tỷ lệ 7:3. Votex nhẹ cho đều hỗn hợp, để vào tủ lạnh ở ngăn mát trong 3 giờ rồi đem bảo quản ở - 800C.
2.2.2 Tuyển chọn chủng sinh bacteriocin
Mục tiêu của thí nghiệm là tuyển chọn được các chủng sinh bacteriocin từ bộ sưu tập chủng phân lập được.
2.2.2.1 Xác định hoạt tính kháng khuẩn của các chủng
Để thử tính đối kháng của các chủng vi khuẩn phân lập được đối với 2 chủng chỉ thị là V1.1 và B1.1, tiến hành xác định hoạt tính kháng khuẩn theo phương pháp khếch tán thạch.
Dịch vi khuẩn sau khi nuôi trong 18 – 24 giờ, tiến hành ly tâm thu dịch bacteriocin thô và điều chỉnh pH về pH 7 – 8 để loại bỏ tác dụng của acid do vi khuẩn lên men sinh ra có trong dịch, sau đó tiến hành thử hoạt tính với các chủng chỉ thị.
Hoạt tính kháng khuẩn được xác định bằng phương pháp khếch tán trên thạch. Đối với phương pháp này chủng vi khuẩn thử nghiệm và chủng chỉ thị cùng được nuôi trên một môi trường, và tính đối kháng thể hiện ở việc chất ức chế của chủng thử nghiệm khếch tán vào môi trường và gây ức chế chủng chỉ thị. Sử dụng đĩa thạch đã nuôi cấy chủng chỉ thị, sau đó tạo các giếng trên thạch bằng cách đục lỗ, tra dịch chủng thử nghiệm đã được ly tâm và ủ ở nhiệt độ thích hợp. Phương pháp này thích hợp với kiểm tra những khuẩn lạc riêng rẽ và áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu về mặt di truyền.
Hình 2.3: Quy trình thử tính kháng khuẩn của dịch bacteriocin thô với chủng chỉ thị
Chuẩn bị môi trường TSB lỏng, rót 20ml môi trường vào các bình tam giác có dung tích 100ml, đem hấp khử trùng 1210C trong 15 phút.
Lấy 1 ống vi khuẩn chủng đích hút 1ml dịch vi khuẩn hút vào các bình tam giác chứa môi trường đã chuẩn bị, nuôi cấy trên máy lắc 180 vòng/phút trong 18 – 20 giờ. Đồng thời, chuẩn bị dịch vi khuẩn cho 2 chủng chỉ thị. Tương tự với vi khuẩn thử nghiệm, nuôi cấy trên máy lắc180 vòng/phút trong 16 – 20 giờ. Sau đó tiến hành thử hoạt tính.
Dùng dịch vi khuẩn thử nghiệm đã nuôi cấy qua đêm chia nhỏ dịch huyền phù vào từng ống eppendorf vô trùng 1,5ml để ly tâm 5000 vòng/phút trong thời gian 30 phút, ở 40C để loại bỏ sinh khối tế bào và thu dịch nổi. Hút dịch nổi và đo pH ban đầu, rồi tiến hành chuẩn độ pH bằng NaOH 0,5N để đưa về pH 7. Bước này nhằm mục đích loại bỏ sự ảnh hưởng của acid do vi khuẩn tiết ra. Nếu pH kiềm thì dùng HCl 0,5N để chuẩn độ về 7.
Dịch vi khuẩn nuôi cấy sau 16 – 20 giờ
Hút 1,5ml dịch vi khuẩn vào eppendolf vô trùng
Ly tâm 5000 vòng/phút, 30 phút, 40C
Chuẩn độ dịch đưa về pH = 7
Thử tính kháng khuẩn
Sau 16 – 24 giờ đọc kết quả Dịch ly tâm
Tiếp theo, tiến hành thử hoạt tính bằng phương pháp khếch tán trên đĩa thạch. Phương pháp này dựa trên khả năng đối kháng giữa vi sinh vật thử nghiệm và vi sinh vật chỉ thị. Chuẩn bị các đĩa thạch môi trường TSA, hút 100µl dịch vi khuẩn chỉ thị được pha loãng theo tỉ lệ 1:9 với nước muối sinh lý trang đều lên bề mặt thạch cho đến khi bề mặt thạch khô. Sau đó, đục 4 – 6 lỗ, với đường kính 5mm trên bề mặt đĩa thạch. Các lỗ đục cách thành đĩa petri khoảng 1cm để có thể quan sát được vòng kháng khuẩn sau này. Dùng micropipet hút 150µl dịch bacteriocin thô cho vào mỗi lỗ thạch, hút 150µl nước cất đã hấp khử trùng ở 1210C cho vào lỗ làm mẫu đối chứng. Tiếp theo, bảo quản các đĩa ở 2-40C trong 2 giờ với mục đích ngăn cản sự phát triển của chủng chỉ thị và tạo điều kiện cho bacteriocin có thời gian thẩm thấu vào bên trong thạch. Sau đó, các đĩa được ủ ở 370C.
Sau 16 -24 giờ thì đọc kết quả. Khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn được xác định bằng sự hiện diện của vòng kháng khuẩn xung quanh lỗ. Nếu đường kính vùng kháng khuẩn lớn hơn hoặc bằng 6mm thì được xem là có khả năng ức chế tích cực.
Đường kính vùng kháng khuẩn được tính như sau: H = D – d
Trong đó H: đường kính vùng kháng khuẩn xung quanh lỗ D: đường kính vùng ức chế (bao gồm đường kính lỗ) d: đường kính lỗ
Hình 2.4: Vùng kháng khuẩn của dịch bacteriocin trên đĩa petri
Đĩa petri
Khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch
Lỗ chứa dịch bacteriocin thô
2.2.2.2 Xác định hoạt tính bacteriocin
Để kiểm tra bản chất của chất kháng khuẩn trong dịch bacteriocin thô của vi khuẩn thử nghiệm có phải là protein không, tiến hành xác định hoạt tính bacteriocin với enzyme proteinase K và enzyme trypsin.
Bacteriocin có bản chất là protein nên dưới tác dụng của enzyme proteinase K, enzyme trypsin và một số enzyme khác như lipase, papain… sẽ làm bacteriocin bị thủy phân, mất hoạt tính kháng khuẩn với các chủng chỉ thị.
Quy trình được tiến hành như sau
Hình 2.5 : Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định hoạt tính bacteriocin
Sử dụng dịch vi khuẩn thử nghiệm đã ly tâm và được chuẩn độ về pH = 7 bằng NaOH 0,5N hoặc HCl 0,5N.
Pha sẵn enzyme proteinase K, enzyme trypsin và catalase với nồng độ 20mg/ml, đem bảo quản lạnh ở -210
C, khi cần dùng thì mới lấy ra hút nhanh cho vào dịch bacteriocin thô.
Chuẩn độ dịch về pH = 7 Bổ sung Catalase, ủ 370C, 30 phút Dịch ly tâm Thử tính kháng khuẩn Bổ sung proteinase K, ủ 370C, 2 giờ Bổ sung trypsin, ủ 370C, 2 giờ
Bổ sung enzyme catalase vào dịch bacteriocin thô cho đạt nồng độ cuối cùng là 0,5ml, ủ ở 370C trong 30 phút, để loại trừ khả năng ức chế của hydrogen peroxide. Sau đó, bổ sung các enzyme proteinase K, enzyme trypsin vào dịch bacteriocin thô tới nồng độ enzyme cuối cùng là 1mg/ml. Mẫu đã xử lý enzyme được ủ ở 370C trong 2 giờ.
Song song với việc chuẩn bị mẫu đối chứng, là dịch không đem xử lý enzyme, để ở nhiệt độ phòng để dễ dàng giúp ta nhận biết được khả năng kháng khuẩn của nó qua kích thước vòng kháng khuẩn.
Sử dụng dịch đã xử lý để tiến hành thử enzyme cũng bằng phương pháp khếch tán trên thạch, với môi trường thạch TSA và 2 chủng chỉ thị V1.1 và B1.1. Phương pháp tiến hành như mục 2.2.2.1. Ủ đĩa ở 370
C trong 16-24 giờ thì kiểm tra sự tạo thành vòng kháng khuẩn và đo kích thước vòng kháng.
2.2.3 Xác định đặc điểm của chủng vi khuẩn sinh bacteriocin
Xác định đặc điểm của các chủng vi sinh vật kiểm định cũng chính là phương pháp định danh vi sinh vật theo phương pháp truyền thống dựa trên các đặc điểm về hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa. Dựa vào đó, ta có thể phân loại chúng.
Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Hình 2.6: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định đặc điểm vi khuẩn
2.2.3.1 Quan sát hình thái tế bào vi khuẩn, nhuộm Gram
Để xác nhận vi khuẩn kiểm định là vi khuẩn Gram dương hay vi khuẩn Gram âm, tiến hành quan sát tế bào vi khuẩn.
Nuôi cấy chủng vi sinh vật được tuyển chọn
Quan sát hình thái tế bào vi khuẩn Test sinh hóa
Dựa trên khả năng bắt màu của tế bào chất và màng tế bào với thuốc nhuộm. Vi khuẩn Gram (-) bắt màu hồng của thuốc nhuộm fuchsin, vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím của violet.
Tiến hành nhuộm như sau:
Chuẩn bị lam kính, dùng bút viết kính đánh dấu giới hạn vùng phết vi khuẩn mặt sau lam kính. Sau đó, nhỏ 1 giọt nước cất vào vòng tròn đã vẽ.
Dùng que cấy vô trùng lấy một ít khuẩn lạc đại diện cho vi khuẩn kiểm định từ thạch, rồi đưa vào lam kính, dàn đều vi khuẩn, để khô tự nhiên hoặc hơ nhẹ trên ngọn đèn cồn, tránh để lâu quá, nóng sẽ vỡ tế bào vi khuẩn, gây sai lệch kết quả.
Tiến hành nhuộm, đầu tiên nhỏ vài giọt tím tinh thể (tím violet) lên tiêu bản, để trong 30 giây đến 1 phút. Nghiêng đổ rồi rửa lại bằng nước cất. Tiếp đó, nhuộm màu tiêu bản bằng thuốc nhuộm Liugol trong thời gian 30 giây đến 1 phút, rồi rửa nhẹ với nước bằng bình tia. Rồi rửa tiêu bản vừa nhuộm với cồn 900 cho đến khu phiến kính bạc màu trong khoảng 10 – 15 giây, rồi rửa lại với nước.
Nhuộm tiếp tiêu bản với Fuchsin trong thời gian 30 giây đến 1 phút, rồi rửa