Mục tiêu của thí nghiệm là tuyển chọn được các chủng sinh bacteriocin từ bộ sưu tập chủng phân lập được.
2.2.2.1 Xác định hoạt tính kháng khuẩn của các chủng
Để thử tính đối kháng của các chủng vi khuẩn phân lập được đối với 2 chủng chỉ thị là V1.1 và B1.1, tiến hành xác định hoạt tính kháng khuẩn theo phương pháp khếch tán thạch.
Dịch vi khuẩn sau khi nuôi trong 18 – 24 giờ, tiến hành ly tâm thu dịch bacteriocin thô và điều chỉnh pH về pH 7 – 8 để loại bỏ tác dụng của acid do vi khuẩn lên men sinh ra có trong dịch, sau đó tiến hành thử hoạt tính với các chủng chỉ thị.
Hoạt tính kháng khuẩn được xác định bằng phương pháp khếch tán trên thạch. Đối với phương pháp này chủng vi khuẩn thử nghiệm và chủng chỉ thị cùng được nuôi trên một môi trường, và tính đối kháng thể hiện ở việc chất ức chế của chủng thử nghiệm khếch tán vào môi trường và gây ức chế chủng chỉ thị. Sử dụng đĩa thạch đã nuôi cấy chủng chỉ thị, sau đó tạo các giếng trên thạch bằng cách đục lỗ, tra dịch chủng thử nghiệm đã được ly tâm và ủ ở nhiệt độ thích hợp. Phương pháp này thích hợp với kiểm tra những khuẩn lạc riêng rẽ và áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu về mặt di truyền.
Hình 2.3: Quy trình thử tính kháng khuẩn của dịch bacteriocin thô với chủng chỉ thị
Chuẩn bị môi trường TSB lỏng, rót 20ml môi trường vào các bình tam giác có dung tích 100ml, đem hấp khử trùng 1210C trong 15 phút.
Lấy 1 ống vi khuẩn chủng đích hút 1ml dịch vi khuẩn hút vào các bình tam giác chứa môi trường đã chuẩn bị, nuôi cấy trên máy lắc 180 vòng/phút trong 18 – 20 giờ. Đồng thời, chuẩn bị dịch vi khuẩn cho 2 chủng chỉ thị. Tương tự với vi khuẩn thử nghiệm, nuôi cấy trên máy lắc180 vòng/phút trong 16 – 20 giờ. Sau đó tiến hành thử hoạt tính.
Dùng dịch vi khuẩn thử nghiệm đã nuôi cấy qua đêm chia nhỏ dịch huyền phù vào từng ống eppendorf vô trùng 1,5ml để ly tâm 5000 vòng/phút trong thời gian 30 phút, ở 40C để loại bỏ sinh khối tế bào và thu dịch nổi. Hút dịch nổi và đo pH ban đầu, rồi tiến hành chuẩn độ pH bằng NaOH 0,5N để đưa về pH 7. Bước này nhằm mục đích loại bỏ sự ảnh hưởng của acid do vi khuẩn tiết ra. Nếu pH kiềm thì dùng HCl 0,5N để chuẩn độ về 7.
Dịch vi khuẩn nuôi cấy sau 16 – 20 giờ
Hút 1,5ml dịch vi khuẩn vào eppendolf vô trùng
Ly tâm 5000 vòng/phút, 30 phút, 40C
Chuẩn độ dịch đưa về pH = 7
Thử tính kháng khuẩn
Sau 16 – 24 giờ đọc kết quả Dịch ly tâm
Tiếp theo, tiến hành thử hoạt tính bằng phương pháp khếch tán trên đĩa thạch. Phương pháp này dựa trên khả năng đối kháng giữa vi sinh vật thử nghiệm và vi sinh vật chỉ thị. Chuẩn bị các đĩa thạch môi trường TSA, hút 100µl dịch vi khuẩn chỉ thị được pha loãng theo tỉ lệ 1:9 với nước muối sinh lý trang đều lên bề mặt thạch cho đến khi bề mặt thạch khô. Sau đó, đục 4 – 6 lỗ, với đường kính 5mm trên bề mặt đĩa thạch. Các lỗ đục cách thành đĩa petri khoảng 1cm để có thể quan sát được vòng kháng khuẩn sau này. Dùng micropipet hút 150µl dịch bacteriocin thô cho vào mỗi lỗ thạch, hút 150µl nước cất đã hấp khử trùng ở 1210C cho vào lỗ làm mẫu đối chứng. Tiếp theo, bảo quản các đĩa ở 2-40C trong 2 giờ với mục đích ngăn cản sự phát triển của chủng chỉ thị và tạo điều kiện cho bacteriocin có thời gian thẩm thấu vào bên trong thạch. Sau đó, các đĩa được ủ ở 370C.
Sau 16 -24 giờ thì đọc kết quả. Khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn được xác định bằng sự hiện diện của vòng kháng khuẩn xung quanh lỗ. Nếu đường kính vùng kháng khuẩn lớn hơn hoặc bằng 6mm thì được xem là có khả năng ức chế tích cực.
Đường kính vùng kháng khuẩn được tính như sau: H = D – d
Trong đó H: đường kính vùng kháng khuẩn xung quanh lỗ D: đường kính vùng ức chế (bao gồm đường kính lỗ) d: đường kính lỗ
Hình 2.4: Vùng kháng khuẩn của dịch bacteriocin trên đĩa petri
Đĩa petri
Khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch
Lỗ chứa dịch bacteriocin thô
2.2.2.2 Xác định hoạt tính bacteriocin
Để kiểm tra bản chất của chất kháng khuẩn trong dịch bacteriocin thô của vi khuẩn thử nghiệm có phải là protein không, tiến hành xác định hoạt tính bacteriocin với enzyme proteinase K và enzyme trypsin.
Bacteriocin có bản chất là protein nên dưới tác dụng của enzyme proteinase K, enzyme trypsin và một số enzyme khác như lipase, papain… sẽ làm bacteriocin bị thủy phân, mất hoạt tính kháng khuẩn với các chủng chỉ thị.
Quy trình được tiến hành như sau
Hình 2.5 : Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định hoạt tính bacteriocin
Sử dụng dịch vi khuẩn thử nghiệm đã ly tâm và được chuẩn độ về pH = 7 bằng NaOH 0,5N hoặc HCl 0,5N.
Pha sẵn enzyme proteinase K, enzyme trypsin và catalase với nồng độ 20mg/ml, đem bảo quản lạnh ở -210
C, khi cần dùng thì mới lấy ra hút nhanh cho vào dịch bacteriocin thô.
Chuẩn độ dịch về pH = 7 Bổ sung Catalase, ủ 370C, 30 phút Dịch ly tâm Thử tính kháng khuẩn Bổ sung proteinase K, ủ 370C, 2 giờ Bổ sung trypsin, ủ 370C, 2 giờ
Bổ sung enzyme catalase vào dịch bacteriocin thô cho đạt nồng độ cuối cùng là 0,5ml, ủ ở 370C trong 30 phút, để loại trừ khả năng ức chế của hydrogen peroxide. Sau đó, bổ sung các enzyme proteinase K, enzyme trypsin vào dịch bacteriocin thô tới nồng độ enzyme cuối cùng là 1mg/ml. Mẫu đã xử lý enzyme được ủ ở 370C trong 2 giờ.
Song song với việc chuẩn bị mẫu đối chứng, là dịch không đem xử lý enzyme, để ở nhiệt độ phòng để dễ dàng giúp ta nhận biết được khả năng kháng khuẩn của nó qua kích thước vòng kháng khuẩn.
Sử dụng dịch đã xử lý để tiến hành thử enzyme cũng bằng phương pháp khếch tán trên thạch, với môi trường thạch TSA và 2 chủng chỉ thị V1.1 và B1.1. Phương pháp tiến hành như mục 2.2.2.1. Ủ đĩa ở 370
C trong 16-24 giờ thì kiểm tra sự tạo thành vòng kháng khuẩn và đo kích thước vòng kháng.