II.1 Thiết kế nghiên cứu
Phƣơng pháp nghiên cứu: Mô tả cắt ngang
Vật liệu và Đối tuợng nghiên cứu:
1. Chủng vi sinh: S. suis serotype 2 và các chủng S. suis với các serotype khác nhau, cụ thể: serotype 15,16,28 (chủng này cho kết quả dƣơng tính với cả 3 loại huyết thanh định serotype 15,16 và 28); serotype 12; serotype 25; serotype 33; serotype 9,31; serotype 15,20; serotype 1; serotype 3; serotype 13; serotype 26; serotype 16,28; serotype 1,12; serotype 16; S. suis serotype 6; serotype 8 và serotype 14.
Các chủng E.coli; Acinetobacter; Staphylococcus aureus; Salmonella;
Streptococcus pneumoniae; Pseudomonas aeruginosa; Pasteurella
multocida; Klebsiella; Methicilline Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA); MSSA
2. Mẫu mô và mẫu máu không đông trong ống chứa sodium citrate và huyết thanh của heo bệnh tai xanh đƣợc xác định chẩn đoán dựa vào lâm sàng 3. Mẫu máu của heo khỏe không có biểu hiện bệnh thu đƣợc nhận tại các hộ
chăn nuôi không có heo bệnh trong suốt đợt dịch heo tai xanh (tuổi heo không hoàn toàn tƣơng ứng giữa 2 nhóm heo bệnh và heo khỏe)
Tiêu chuẩn chọn mẫu o Heo bệnh tai xanh:
Heo trong tỉnh đã công bố dịch tai xanh
Heo đƣợc nuôi trong nhiều hộ gia đình khác nhau và có biểu hiện lâm sàng nhƣ sau:
VẬT LIỆU PHƢƠNG PHÁP
33
NTH-PPV:SS-PRRS: BÁO CÁO NGHIỆM THU 1/2013
Bỏ ăn
Da có biểu hiện tím/hồng trên vùng da mỏng (vùng bụng và tai)
Có biểu hiện bệnh về hô hấp nhƣ khó thở, ho
Sƣng mí mắt, viêm kết mạc trên heo con và heo thịt
Heo nái đã bị xảy thai trong thời gian xảy ra dịch
Xác định nhiễm vi-rút PRRS bằng phƣơng pháp RT-rtPCR . o Heo không có biểu hiện lâm sàng (nhóm đối chứng- heo khỏe)
Heo khỏe không có triệu chứng lâm sàng của bệnh tai xanh hay bệnh khác.
Đƣợc xác nhận đàn heo không nhiễm virút PRRS bằng RT- rtPCR
Thu nhận mẫu
o Thu nhận mẫu: thực hiện tại hiện trƣờng
Mẫu máu không đông, huyết thanh của 5 heo trên 1 trại và thu mẫu của 100 trại heo tại 2 tỉnh có dịch heo tai xanh.
Mẫu mô: lách, thận, gan, tim, phổi, hạch phổi đuợc thu nhận tùy thuộc vào điều kiện tại hiện truờng giết mổ đảm bảo việc thực hiện đƣợc thuận lợi và hạn chế nguy cơ ngoại nhiễm.
VẬT LIỆU PHƢƠNG PHÁP
Sơ đồ nghiên cứu
Hình II-1: Sơ đồ thiết kế nghiên cứu
II.2 Nội dung nghiên cứu
II.2.1 Nội dung 1: Xác định heo bệnh nhiễm vi-rút gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (heo bệnh PRRS) và ngưỡng phát hiện của phản ứng RT-rtPCR
II.2.1.1 Xác định sự hiện diện của vi-rút
Phản ứng khuếch đại RNA đƣợc tiến hành nhằm khuếch đại đoạn RNA đặc hiệu cho chủng PRRSV Trung Quốc, là chủng đã đƣợc Cục Thú Y xác định đang gây dịch tại các tỉnh [47]. Phƣơng pháp Real time PCR phiên mã ngƣợc mô phỏng theo
Mẫu máu (~500)
Mẫu huyết tƣơng Mẫu máu toàn phần Phát hiện H-PRRSV Phƣơng pháp RT-rtPCR Phân lập và định danh Phƣơng pháp vi sinh truyền thống Tách chiết DNA Dùng QIAamp DNA Blood Midi kit
Tách chiết RNA
Dùng QIAamp Viral RNA Mini kit
Kiểm tra tính mẫn cảm với kháng sinh Phƣơng pháp sử dụng đĩa kháng sinh Phát hiện SS2 Phƣơng pháp rtPCR Phát hiện SS Phƣơng pháp 16S PCR
VẬT LIỆU PHƢƠNG PHÁP
35
NTH-PPV:SS-PRRS: BÁO CÁO NGHIỆM THU 1/2013
qui trình đã đƣợc công bố [11]. Qui trình sao mã ngƣợc RTPCR đƣợc tóm tắt bên dƣới và đính kèm trong phần phụ lục. Mồi và mẫu dò cho phản ứng đƣợc cung cấp bởi Sigma - Singapore.
Chúng tôi tiến hành thực hiện RTPCR khuếch đại đoạn gen của nsp2 nhằm phát hiện PRRSV trên những mẫu huyết tƣơng đƣợc chọn ngẫu nhiên từ nhữnghộ chăn nuôi. RNA đƣợc tách chiết bằng QIAamp viral RNA Mini Spin Columns Kit (Qiagen, UK). Đồng thời, RNA của vi-rút EAV (Equine arteritis vi-rút) đƣợc dùng làm chứng nội tại trong quá trình tách chiết RNA vi-rút và thực hiện phản ứng RT- rtPCR phát hiện vi-rút PRRS [11].
Chƣơng trình khuếch đại gồm bƣớc đầu tổng hợp cDNA sử dụng mồi random hexamer primers (Roche, Việt Nam) và 45 chu kỳ khuếch đại.
Qui trình tổng hợp cDNA từ RNA vi-rút đƣợc thực hiện nhƣ sau: Hỗn hợp 1 gồm 1 μl Random hexamers (20ng/ μl), 1 μl dNTPs (10 mM), 3 μl nƣớc, 8 μl RNA vi-rút. Hỗn hợp 2 gồm 4 μl 5X dung dịch đệm, 1 μl DTT (0.1M), 0,4 μl Rnase Inhibitor (40U/μl), 0,2 μl Superscript III reverse transcriptase, 1,4 μl nƣớc. Hỗn hợp 1 đƣợc ủ ở 65oC trong 5 phút và nhanh chóng làm lạnh trên đá ít nhất 1 phút. Sau đó cho toàn bộ dung dịch hỗn hợp 2 vào trong hỗn hợp 1 và chạy chƣơng trình tổng hợp cDNA (25oC trong 5 phút, 50oC trong 60 phút và 70oC trong 15 phút).
Hỗn hợp thành phần rtPCR cho thể tích 25 µl (1X dung dịch đệm, 2,8 µM MgCl2, 0,4 µM dNTPs, 0,2 µM EAV–Forward primer, 0,2 µM EAV–Reverse primer, 0,1 µM EAV-probeCy5, 0,2 µM CN-PRRS–Forward primer, 0,2 µM CN-PRRS – Reverse primer, 0,1 µM CN-PRRS –probeFAM, 0,1U/ µl Hot start polymerase, 5 µl DNA template và nƣớc không chứa nuclease cho đến 25 µl) đƣợc thực hiện theo chu trình nhiệt gồm chƣơng trình biến tính 95oC trong 15 phút, chƣơng trình khuếch đại lặp lại 44 lần (95o
C trong 30 giây, 60oC trong 30 giây, 72oC trong 30 giây), đọc tín hiệu huỳnh quang sau bƣớc kéo dài 72oC ở mỗi chu kỳ.
VẬT LIỆU PHƢƠNG PHÁP
Kết quả rtPCR đƣợc xem là dƣơng tính nếu các chứng âm (không có DNA mục tiêu) đều âm, chứng nội có giá trị Ct (Cy5) trong khoảng 33-35 và mẫu có giá trị Ct (FAM) ≤ 40. Ngƣợc lại, các mẫu đƣợc xem là âm tính nếu các chứng âm đều âm, chứng nội có Ct (Cy5) trong khoảng 33-35 nhƣng mẫu không thu đƣợc giá trị Ct (FAM) hay giá trị Ct (FAM)> 40. Các mẫu có giá trị Ct (FAM)> 38 cần đƣợc lặp lại kiểm tra để xác định kết quả 3 lần. Nếu chứng nội có giá trị Ct (CY5) nằm ngoài khoảng mong đợi và mẫu có giá trị Ct (FAM)> 40 hoặc không thu đƣợc giá trị Ct (FAM) thì kết quả xem nhƣ không xác định; trong trƣờng hợp này cần tách chiết DNA từ đầu và lặp lại phản ứng rtPCR.
II.2.1.2 Phân lập vi-rút
Một số mẫu mô và huyết tƣơng của heo cho kết quả dƣơng tính với RT-rtPCR khuếch đại gen nsp2 của vi-rút PRRS đƣợc dùng để phân lập vi-rút theo sơ đồ sau: Giai đoạn chuẩn bị
Cho 5 x 105 tế bào MARC-145 vào flask 25 cm2 Ủ ở 37o
C/ 3-5% CO2
VẬT LIỆU PHƢƠNG PHÁP
37
NTH-PPV:SS-PRRS: BÁO CÁO NGHIỆM THU 1/2013
Phân lập vi-rút
Bước 1: Nghiền 0.5 g mẫu mô trong 5ml PBS chứa 2x kháng sinh
Bước 2: Đổ dịch nghiền vào trong một ống falcon sạch
Bước 3: Ly tâm 2000 g trong 5 phút
Bước 4: Thu nhận dịch nổi trong một ống falcon sạch
Bước 5: Cho 1 ml dịch nổi vào flask 25 cm2
có 100% tế bào đơn đã chuẩn bị.
Bước 5: Ủ tại 37o
C/3-5% trong 24 h
Bước 7: Đổ bỏ môi trƣờng
Bước 8: Rửa tế bào với 10 ml PBS chứa 2x kháng sinh
Bước 9: Đổ bỏ PBS
Bước 10: Cho 10 ml môi trƣờng duy trì (MM) vào mỗi flask 25 cm2
.
Bước 11: Ủ tại 37o
C/3-5% trong 24 giờ
Bước 13: Kiểm tra hằng ngày để xác định Cytopathic Effect (CPE) và tế bào
chết do độc tố của mẫu trong 5 – 7 ngày.
VẬT LIỆU PHƢƠNG PHÁP
Môi truờng sử dụng
Môi trƣờng duy trì (Maintenance Media (MM – MARC145 cells) 500ml Eagles Minimum Essential Media (EMEM) 2% Foetal Calf Serum (FCS)
0,25% Penicillin/Streptomycin 2ug/ml Fungizone
10mM Hepes 1% Na Pyruvate 2mM Glutamine
0,5% Lactalbumin hydrolysate (LAH) Phosphate Buffered Saline (PBS)
8g NaCl 0,2g KCl
1,15g Na2HPO4 0,2g KH2PO4
(0,5% Penicillin/Streptomycin + 4ug/ml Fungizone)
II.2.1.3 Xác định ngưỡng phát hiện của phương pháp phát hiện RT PCR – PRRS (nps2)
Ngƣỡng phát hiện hay còn gọi là giới hạn phát hiện hay độ nhạy phân tích của phƣơng pháp là nồng độ thấp nhất của thành phần cần xác định trong mẫu đƣợc xác định một cách nhất quán, không định lƣợng, trong điều kiện phòng thí nghiệm với loại mẫu nhất định [54]. Ngƣỡng phát hiện là đặc tính quan trọng cần đƣợc xác định cho cả test định tính và định lƣợng. Biết ngƣỡng phát hiện của phƣơng pháp sẽ giúp hiểu đƣợc tại giới hạn nào phản ứng sẽ cho kết quả âm tính giả. Điều này
VẬT LIỆU PHƢƠNG PHÁP
39
NTH-PPV:SS-PRRS: BÁO CÁO NGHIỆM THU 1/2013
có thể đóng vai trò quan trọng trong quản lý dịch bệnh của virut gây bệnh có thể lây lan nhanh nhƣ PRRS.
Ngƣỡng phát hiện có thể đƣợc xác định bằng bằng cách: (1) sử dụng thống kê, (2)
sử dụng thực nghiệm, thử nghiệm với dãy mẫu pha loãng với nồng độ đƣợc biết
trƣớc của thành phần, loại mẫu cần xác định. Trong các xét nghiệm, ngƣỡng phát
hiện thƣờng đƣợc xác định bằng phƣơng pháp thực nghiệm.
Để xác định ngƣỡng phát hiện của phƣơng pháp rtPCR, dãy nồng độ pha loãng có thể đƣợc chuẩn bị bằng cách xác định nồng độ vi-rút với phƣơng pháp plaque assay hay tạo dòng.
A. Xác định nồng độ vi-rút bằng phương pháp plaque assay
Để xác định độ nhạy của phản ứng RT-rtPCR dùng phát hiện PRRSV genotype Trung Quốc chúng tôi tiến hành thực hiện plaque assay để xác định nồng độ vi-rút trong mẫu ban đầu. Sau đó tiến hành pha loãng và tách chiết RNA vi-rút và thực hiện phản ứng RT-rtPCR để xác định ngƣỡng phát hiện. Plaque assay đựơc chúng tôi tiến hành theo sơ đồ ở trang bên.
VẬT LIỆU PHƢƠNG PHÁP
Hình II-2: Sơ đồ thực hiện plaque assay
Nuôi cấy tế bào MARC-145 trên flask 125 cm2
Cho 2.5 x 105 đến 3 x 105 tế bào trong môi trƣờng GM vào mỗi giếng của đĩa
6 giếng
Vi-rút CN-PRRSV đƣợc giữ ở -80oC (Ct 21-22)
Làm tan vi-rút trong waterbath tại 37oC
Dùng pipet hút bỏ môi trƣờng
Rửa 3 lần với 4 ml PBS ABC
Ủ 37oC trong 2 ngày
Pha loãng vi-rút từ 10-1 đến 10-4 trong môi trƣờngVIM Ủ 37oC/5%CO2 trong 1h
Cho vào 200 µl dịch pha loãng vi-rút vào mỗi giếng
Ủ lắc ở 40 rpm tại 37o
C/5%CO2 trong 1h
Cho 3ml môi trƣờng phủ Avicel 1.2% vào mỗi giếng Ủ 37oC/5%CO2 trong 5 ngày
Hút bỏ dịch vi-rút
Hút bỏ môi trƣờng phủ Rửa 2 lần với 3 ml PBS/lần Cố định tế bào bằng 1ml methanol lạnh/giếng
Ủ ở -20oC trong 30 phút Cho vào 1ml NBB/giếng
Hút bỏ NBB Rửa nhẹ nhàng dƣới vòi nƣớc
Ủ 30 phút tại nhiệt độ phòng
VẬT LIỆU PHƢƠNG PHÁP
41
NTH-PPV:SS-PRRS: BÁO CÁO NGHIỆM THU 1/2013
Bảng II-1: Các môi truờng sử dụng cho thí nghiệm tạo plaque của vi-rút PRRS
GM 1X (Môi trường nuôi cấy)
Thành Phần Nồng độ FCS 8% Hepes 1M Glutamine 2mM or 0,292mg/ml LAH 0.50% Na pyruvat 1 mM P/S 10 units/ml Pn 10 µg/ml St Fungizone 0,25µg/ml NaHCO3 0,70% EMEM 1x 1X
VIM (Môi truờng phân lập vi-rút)
Thành phần Nồng độ FCS 2% Hepes 1M Glutamine 2mM or 0,292mg/ml LAH 25% 0.50% Na pyruvat 1 mM P/S 10 units/ml Pn 10 µg/ml St Fungizone 0,25µg/ml NaHCO3 0,70% EMEM 1X 1X Môi trường phủ Thành phần Nồng độ Avicel 1,20% GM2X 1 X
VẬT LIỆU PHƢƠNG PHÁP
B. Tạo dòng plasmid mang đoạn gen nsp2
Nhằm mục đích xác định ngƣỡng phát hiện của phản ứng RT-rtPCR [11] phát hiện RNA của vi-rút PRRS, chúng tôi thử nghiệm tiến hành xác định nồng độ của vi-rút PRRS bằng phƣơng pháp tạo plaque. Tuy nhiên mặc dù quan sát đƣợc CPE (cytopathic effect) nhƣng chúng tôi không thể quan sát và xác định đƣợc hình ảnh tạo plague trên đĩa/ giếng nuôi cấy tế bào. Do vậy, nhằm xác định ngƣỡng phát hiện của vi-rút PRRS chúng tôi tiến hành tạo dòng đoạn gen mục tiêu của gen nsp2
của PRRSV vào vector. Vector này sẽ đƣợc tinh sạch, xác định nồng độ và dùng làm mạch khuôn trong khảo sát xác định ngƣỡng phát hiện của phƣơng pháp. Trong phản ứng RT-rtPCR phát hiện RNA của PRRSV, chúng tôi luôn dùng một RNA của EAV làm mạch khuôn của chứng nội. Do vậy, chúng tôi cũng tạo dòng đoạn gen EAV vào plasmid.
RNA của vi-rút PRRS và EAV đƣợc ly trích và phiên mã ngƣợc riêng biệt. Sau đó, cDNA vừa đƣợc tổng hợp sẽ đƣợc dùng làm mạch khuôn trong phản ứng PCR riêng biệt để khuếch đại đoạn gen mục tiêu. Sản phẩm PCR đƣợc xác định trên gel agarose và sau đó đƣợc tạo dòng vào vector pCR2.1 / pCR2.1 Topo (Invitrogen) theo nguyên tắc bổ sung T-A và đƣợc chuyển vào tế bào khả nạp DH5α (tế bào này đƣợc chuẩn bị khả nạp tại phòng thí nghiêm bằng phƣơng pháp dùng CaCl2). Tế bào đƣợc cấy trãi trên đĩa thạch LB có chứa 100ng/ ml Ampicillin với sự hiện diện của X-gal (hình II-5). Khuẩn lạc có màu trắng sẽ đƣợc chọn với chỉ thị là các khuẩn lạc có mang plasmid có chứa đoạn chèn. Các đoạn chèn đƣợc kiểm tra bằng PCR với primer M13.
VẬT LIỆU PHƢƠNG PHÁP
43
NTH-PPV:SS-PRRS: BÁO CÁO NGHIỆM THU 1/2013
Hình II-5: Sơ đồ tạo dòng gen nsp2 của PRRSV
RNA của EAV
Ly trích RNA của vi-rút PRRS
RNA của PRRSV
Phiên mã ngƣợc
PCR
Tinh sạch sản phẩm PCR
Tạo dòng vào plasmid
Biến nạp bằng hóa chất với sốc nhiệt
Chọn lọc với X-gal và Ampicillin
khuẩn lạc mọc trên môi trƣờng chứa Ampicillin
Ly trích plasmid
Thực hiện real time PCR
Chuẩn bị tế bào E.coli khả nạp
Xác định sự hiện diện của plasmid
Xác định sự hiện của đoạn chèn
VẬT LIỆU PHƢƠNG PHÁP
Khuếch đại gen đích với 2 bước RT PCR
1. Phiên mã ngƣợc:
Phiên mã ngƣợc đƣợc thực hiện với hexamer primer để tổng hợp cDNA từ RNA của vi-rút PRRS (hay EAV). Phản ứng đƣợc tiến hành với 2 hỗn hợp và chu trình nhiệt nhƣ bảng II-2. cDNA sau khi đƣợc tổng hợp sẽ đƣợc lƣu ở -70o
C.
Bảng II-2: Thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng phiên mã ngược khuếch đại RNA của vi-rút PRRS
Nguyên liệu Nồng độ cuối Thể tích (μl)
Hỗn hợp 1 Random hexamers 20ng/ μl 1ng 1 dNTPs 10 mM 0.5mM 1 Nƣớc 3 RNA 8 Hỗn hợp 2 5X buffer 1X 4 DTT 0.1M 0.005M 1
Rnase Inhibitor 40U/μl 16U 0,4
Superscript III reverse
transcriptase 200U/ul 40U 0,2
Nƣớc 1,4 Thể tích tổng 20μl Chu trình nhiệt 25 o C/ 5 phút, kế tiếp là 50oC/ 1 giờ và dừng phản ứng ở 70o C / 15 phút.
VẬT LIỆU PHƢƠNG PHÁP
45
NTH-PPV:SS-PRRS: BÁO CÁO NGHIỆM THU 1/2013
2. PCR để khuếch đại đoạn gen
Đoạn DNA 96bp đƣợc khuếch đại sử dụng cặp mồi dùng để phát hiện vi-rút PRRS trong phản ứng real time PCR (rtPCR) ở trên (phát hiện sự hiện diện của vi-rút trong máu heo). Thành phần PCR của phản ứng đƣợc ghi nhận trong bảng II-3 bên dƣới.
Bảng II-3: Thành phần phản ứng PCR khuếch đại cDNA của vi-rút PRRS trong qui trình tạo dòng Thành phần Nồng độ cuối Thể tích (μl) 10X buffer 1X 2,5 MgCl2 25mM 3,5mM 3,5 dNTPs 10mM 0,4mM 1,0 H-PRRS –F 10μM 0,2μM 0,5 H-PRRS –R 10μM 0,2μM 0,5
Hot start Taq polymerase
5U/ul 0,04U 0,2
Nƣớc / 11,8
cDNA template / 5,0
Tổng thể 25μl
3. Tạo dòng
Chúng tôi sẽ dụng plasmid pCR2.1 trong bộ kit (Invitrogen, Cat. No K2020-20) để tạo dòng gắn đoạn sàn phẩm PCR ở trên theo nguyên tắc bổ sung T-A. Sau khi đƣợc nối lại với sự hiện diện của enzyme ligase, hỗn hợp phản ứng đƣợc chuyển vào tube chứa tế bào khả nạp DH5α và trãi lên đĩa chứa kháng sinh Ampicillin và Xgal. Khuẩn lạc màu trắng sẽ đƣợc chọn và kiểm tra bằng PCR sử dụng cặp mồi
VẬT LIỆU PHƢƠNG PHÁP
M13 và mồi đặc hiệu. Plasmid đúng/ mong đợi sẽ đƣợc ly trích từ tế bào sử dụng kit QIAprep Spin Miniprep (Cat. No 12123).
4. Xác định số lƣợng plasmid
Số lƣợng plasmid đƣợc xác định từ việc đo nồng độ dung dịch chứa plasmid tại bƣớc sóng 230nm của máy nanodrop 1000. Trọng lƣợng phân tử của DNA đƣợc xác định tự động sau khi đọc OD. Chúng tôi tính toán số lƣợng plasmid dựa trên trọng lƣợng DNA trong dung dịch ly trích và kích thƣớc của plasmid đã tạo dòng (4025bp= 3929bp+ 96bp). Nồng độ DNA đƣợc tính toán dựa vào việc chấp nhận
