I. Tổng quan
I.7 Các gen mục tiêu đặc hiệu của S suis dùng trong phản ứng khuếch
Dựa trên sự khác biệt về kháng nguyên vỏ nang polysaccharide, 35 serotype huyết thanh đƣợc xác định. Do vậy nhằm phát triển phản ứng khuếch đại DNA đặc hiệu cho một số các serotype, gen tham gia hình thành vỏ nang polysaccharide thƣờng đƣợc chọn là gen đích. Smith và cộng sự đã xác định đƣợc gen cps2J là gen đặc hiệu cho S. suis serotype 2. Do vậy gen cps2J đƣợc chọn là gen đích cho phản ứng khuếch đại xác định SS2 [30]. Phản ứng khuếch đại rtPCR phát hiện cps2J/SS2 đã đƣợc ứng dụng trong chẩn đoán nhiễm S. suis serotype 2 trong mẫu dịch não tủy tại BV Bệnh Nhiệt Đới [31] .
Một số phản ứng PCR phát hiện epf [32], suilysin [33] và gdh [34] cũng đƣợc xây dựng. Tuy nhiên các gen này hoặc không hiện diện trong tất cả các chủng hay tất cả các serotype khác nhau (epf, suilysin) hay chỉ hiện diện với 1 bản sao trong bộ gen (gdh). Trong khi đó 16SrDNA hiện diện với 4 bản sao trong bộ gen của S. suis.
Do vậy việc sử dụng phản ứng khuếch đại đoạn DNA đặc hiệu của 16SrDNA của SS sẽ giúp phát hiện đƣợc tất cả SS thuộc các seotype khác nhau.
TỔNG QUAN
I.8 Nghiên cứu trong nước
Nghiên cứu về vi-rút gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo tại Việt Nam tập trung chủ yếu giải quyết các nhu cầu cấp bách để đối phó với dịch bệnh. Bao gồm các nghiên cứu tập trung vào khảo sát dịch tễ của dịch, phƣơng pháp chẩn đoán, khảo sát đa dạng chủng phân lập từ heo bệnh, khảo sát lƣu hành bệnh, thử nghiệm vắc xin và khảo sát yếu tố nguy cơ nhiễm bệnh của heo [35-47]. Trong các nghiên cứu này, nghiên cứu của Nguyễn Văn Cảm có đề cập đến bội nhiễm của heo bệnh tai xanh với S. suis trong quá trình thử nghiệm vắc xin [48] . Ngoài ra PGS. TS Nguyễn Ngọc Hải cũng đã báo cáo tình trạng nhiễm vi-rút PRRS trên đàn heo sinh sản tại Tp. HCM. Với tỉ lệ nhiễm là 73,33% ở các hộ chăn nuôi và 54,02% ở các trại. Trong đó, heo nái nhiễm với tỉ lệ cao hơn (63,66%) so với heo nọc (42,83%). Tỉ lệ nhiễm PRRSV tại các trại có qui mô công nghiệp trong khảo sát này là 100% trong khi đó tỉ lệ nhiễm tại các cơ sở tƣ nhân là 67,21%. Kết quả này cho thấy tỉ lệ nhiệm PRRSV trên heo ở mức báo động (Đề tài đã nghiệm thu, Sở KHCN TpHCM, 2011) [49]. Tuy nhiên hiện nay chƣa có báo cáo nào có hệ thống về tình trạng đồng nhiễm của S. suis trên heo tai xanh ngoại trừ bài báo cáo gần đây của chúng tôi trên tạp chí CNSH [50].
Thông tin nghiên cứu về liên cầu khuẩn heo tại Việt Nam vẫn còn hạn chế. Tuy nhiên liên cầu khuẩn heo đã đƣợc biết đến nhƣ tác nhân quan trọng gây bệnh VMNM cấp trên ngƣời lớn tại Việt Nam [16, 31]. Trong chƣơng trình nghiên cứu tại Việt Nam từ năm 2005 đến nay, sử dụng phƣơng pháp cấy phân lập vi sinh từ mẫu dịch não tủy và máu cùng với ứng dụng phƣơng pháp rtPCR trong chẩn đoán, chúng tôi đã xác định đƣợc SS2 là tác nhân quan trọng gây VMNM cấp trên ngƣời tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới (BVBNĐ) Tp.HCM và BVBNĐ Trung Ƣơng [16, 31]. Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy SS là tác nhân quan trọng nhất gây bệnh cho 151/450 (33,6%) bệnh nhân VMNM cấp tại BVBNĐ Tp.HCM. Trong đó 50/151 (33,1%) bệnh nhân có tiếp xúc với heo hay thịt heo một tuần trƣớc khi phát
TỔNG QUAN
29
NTH-PPV:SS-PRRS: BÁO CÁO NGHIỆM THU 1/2013
bệnh. Hơn 66% bệnh nhân hồi phục bị giảm thính lực từ ù tai đến điếc hoàn toàn 2 tai. Tỉ lệ bệnh nhân tử vong do liên cầu khuẩn heo tƣơng đối thấp (4%) so với các báo cáo trên thế giới [31]. Trong khi đó, khảo sát tại BV Bệnh Nhiệt Đới Trung Ƣơng cho thấy SS là tác nhân gây bệnh cho 50 (9%) bệnh nhân VMNM cấp nhập viện tại đây và tỉ lệ tử vong do bệnh nhân nhiễm SS là 3/50 (6%). Tổng cộng có 16/50 (32%) bệnh nhân có tiền sử tiếp xúc với heo và 20% số bệnh nhân có biểu hiện giảm thính lực khi xuất viện. Có 8 (16%) bệnh nhân có biểu hiện bệnh nặng cần sự hỗ trợ của máy trợ thở [16].
Trong điều kiện không tìm thấy tài liệu đăng tải trên các tạp chí chuyên ngành quốc tế khẳng định heo tại Việt Nam có mang trùng S. suis. Từ năm 2006, chúng tôi đã tiến hành hợp tác nghiên cứu với các Chi cục Thú y tại Tp.HCM, Tiền Giang và Đồng Nai nhằm khảo sát tình hình mang trùng SS trên heo khỏe và vai trò của SS nhƣ tác nhân gây bệnh cho heo. Kết quả sơ bộ cho thấy heo khoẻ tại các tỉnh phía nam mang trùng SS với tỉ lệ thay đổi từ 14% - 48% , và SS đƣợc phân lập từ một số cơ quan khác nhau của heo bệnh. Kết quả khảo sát kháng sinh đồ của các chủng SS phân lập từ heo trong nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, liên cầu khuẩn heo đã kháng với nhiều loại kháng sinh [51]. Sự đồng nhiễm của SS và vi-rút PRRS trên một heo bệnh lấy mẫu từ Quãng Ngãi đã đƣợc báo cáo [52]. Vi khuẩn
S. suis đã đƣợc phân lập từ mẫu lách, tuy nhiên serotype của vi khuẩn không đƣợc đề cập trong phạm vi bài báo.
Với nỗ lực nhằm tìm hiểu nguy cơ nhiễm SS trên ngƣời TS Hồ Đặng Trung Nghĩa và cộng sự đã xác định tiêu thụ thực phẩm là thịt heo chƣa đƣợc nấu chín nhƣ các cơ quan nội tạng, tiết canh heo là nguy cơ gây nhiễm cho hơn 30% bệnh nhân tại Việt Nam [53]. Theo thống kê tại BV Bệnh Nhiệt Đới Trung Ƣơng, số ca bệnh trên ngƣời do liên cầu khuẩn heo có chiều hƣớng gia tăng trong đợt dịch heo tai xanh. Do vậy nhằm khẳng định nguy cơ này, chúng tôi đã phối hợp với chi cục thú y của hai tỉnh Tiền Giang và Sóc Trăng, là 2 tỉnh đầu tiên công bố dịch heo tai xanh tại
TỔNG QUAN
Miền Nam vào tháng 6/2010, để khảo sát tình trạng bội nhiễm S. suis trên heo nhiễm vi-rút PRRS.
Xác định tình trạng bội nhiễm liên cầu khuẩn heo (Streptococcus suis) trên heo nhiễm vi-rút gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (PRRS) sẽ giúp chúng ta có hiểu rõ hơn về tình trạng bội nhiễm của SS trên heo bệnh tai xanh tại các tỉnh phía nam nhằm hỗ trợ cho tình hình chống dịch trên heo bệnh và đƣa ra khuyến cáo về nguy cơ nhiễm SS trên ngƣời trong giai đoạn dịch heo tai xanh.
31 VẬT LIỆU &
VẬT LIỆU PHƢƠNG PHÁP
II.Thiết kế và nội dung nghiên cứu
II.1 Thiết kế nghiên cứu
Phƣơng pháp nghiên cứu: Mô tả cắt ngang
Vật liệu và Đối tuợng nghiên cứu:
1. Chủng vi sinh: S. suis serotype 2 và các chủng S. suis với các serotype khác nhau, cụ thể: serotype 15,16,28 (chủng này cho kết quả dƣơng tính với cả 3 loại huyết thanh định serotype 15,16 và 28); serotype 12; serotype 25; serotype 33; serotype 9,31; serotype 15,20; serotype 1; serotype 3; serotype 13; serotype 26; serotype 16,28; serotype 1,12; serotype 16; S. suis serotype 6; serotype 8 và serotype 14.
Các chủng E.coli; Acinetobacter; Staphylococcus aureus; Salmonella;
Streptococcus pneumoniae; Pseudomonas aeruginosa; Pasteurella
multocida; Klebsiella; Methicilline Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA); MSSA
2. Mẫu mô và mẫu máu không đông trong ống chứa sodium citrate và huyết thanh của heo bệnh tai xanh đƣợc xác định chẩn đoán dựa vào lâm sàng 3. Mẫu máu của heo khỏe không có biểu hiện bệnh thu đƣợc nhận tại các hộ
chăn nuôi không có heo bệnh trong suốt đợt dịch heo tai xanh (tuổi heo không hoàn toàn tƣơng ứng giữa 2 nhóm heo bệnh và heo khỏe)
Tiêu chuẩn chọn mẫu o Heo bệnh tai xanh:
Heo trong tỉnh đã công bố dịch tai xanh
Heo đƣợc nuôi trong nhiều hộ gia đình khác nhau và có biểu hiện lâm sàng nhƣ sau:
VẬT LIỆU PHƢƠNG PHÁP
33
NTH-PPV:SS-PRRS: BÁO CÁO NGHIỆM THU 1/2013
Bỏ ăn
Da có biểu hiện tím/hồng trên vùng da mỏng (vùng bụng và tai)
Có biểu hiện bệnh về hô hấp nhƣ khó thở, ho
Sƣng mí mắt, viêm kết mạc trên heo con và heo thịt
Heo nái đã bị xảy thai trong thời gian xảy ra dịch
Xác định nhiễm vi-rút PRRS bằng phƣơng pháp RT-rtPCR . o Heo không có biểu hiện lâm sàng (nhóm đối chứng- heo khỏe)
Heo khỏe không có triệu chứng lâm sàng của bệnh tai xanh hay bệnh khác.
Đƣợc xác nhận đàn heo không nhiễm virút PRRS bằng RT- rtPCR
Thu nhận mẫu
o Thu nhận mẫu: thực hiện tại hiện trƣờng
Mẫu máu không đông, huyết thanh của 5 heo trên 1 trại và thu mẫu của 100 trại heo tại 2 tỉnh có dịch heo tai xanh.
Mẫu mô: lách, thận, gan, tim, phổi, hạch phổi đuợc thu nhận tùy thuộc vào điều kiện tại hiện truờng giết mổ đảm bảo việc thực hiện đƣợc thuận lợi và hạn chế nguy cơ ngoại nhiễm.
VẬT LIỆU PHƢƠNG PHÁP
Sơ đồ nghiên cứu
Hình II-1: Sơ đồ thiết kế nghiên cứu
II.2 Nội dung nghiên cứu
II.2.1 Nội dung 1: Xác định heo bệnh nhiễm vi-rút gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (heo bệnh PRRS) và ngưỡng phát hiện của phản ứng RT-rtPCR
II.2.1.1 Xác định sự hiện diện của vi-rút
Phản ứng khuếch đại RNA đƣợc tiến hành nhằm khuếch đại đoạn RNA đặc hiệu cho chủng PRRSV Trung Quốc, là chủng đã đƣợc Cục Thú Y xác định đang gây dịch tại các tỉnh [47]. Phƣơng pháp Real time PCR phiên mã ngƣợc mô phỏng theo
Mẫu máu (~500)
Mẫu huyết tƣơng Mẫu máu toàn phần Phát hiện H-PRRSV Phƣơng pháp RT-rtPCR Phân lập và định danh Phƣơng pháp vi sinh truyền thống Tách chiết DNA Dùng QIAamp DNA Blood Midi kit
Tách chiết RNA
Dùng QIAamp Viral RNA Mini kit
Kiểm tra tính mẫn cảm với kháng sinh Phƣơng pháp sử dụng đĩa kháng sinh Phát hiện SS2 Phƣơng pháp rtPCR Phát hiện SS Phƣơng pháp 16S PCR
VẬT LIỆU PHƢƠNG PHÁP
35
NTH-PPV:SS-PRRS: BÁO CÁO NGHIỆM THU 1/2013
qui trình đã đƣợc công bố [11]. Qui trình sao mã ngƣợc RTPCR đƣợc tóm tắt bên dƣới và đính kèm trong phần phụ lục. Mồi và mẫu dò cho phản ứng đƣợc cung cấp bởi Sigma - Singapore.
Chúng tôi tiến hành thực hiện RTPCR khuếch đại đoạn gen của nsp2 nhằm phát hiện PRRSV trên những mẫu huyết tƣơng đƣợc chọn ngẫu nhiên từ nhữnghộ chăn nuôi. RNA đƣợc tách chiết bằng QIAamp viral RNA Mini Spin Columns Kit (Qiagen, UK). Đồng thời, RNA của vi-rút EAV (Equine arteritis vi-rút) đƣợc dùng làm chứng nội tại trong quá trình tách chiết RNA vi-rút và thực hiện phản ứng RT- rtPCR phát hiện vi-rút PRRS [11].
Chƣơng trình khuếch đại gồm bƣớc đầu tổng hợp cDNA sử dụng mồi random hexamer primers (Roche, Việt Nam) và 45 chu kỳ khuếch đại.
Qui trình tổng hợp cDNA từ RNA vi-rút đƣợc thực hiện nhƣ sau: Hỗn hợp 1 gồm 1 μl Random hexamers (20ng/ μl), 1 μl dNTPs (10 mM), 3 μl nƣớc, 8 μl RNA vi-rút. Hỗn hợp 2 gồm 4 μl 5X dung dịch đệm, 1 μl DTT (0.1M), 0,4 μl Rnase Inhibitor (40U/μl), 0,2 μl Superscript III reverse transcriptase, 1,4 μl nƣớc. Hỗn hợp 1 đƣợc ủ ở 65oC trong 5 phút và nhanh chóng làm lạnh trên đá ít nhất 1 phút. Sau đó cho toàn bộ dung dịch hỗn hợp 2 vào trong hỗn hợp 1 và chạy chƣơng trình tổng hợp cDNA (25oC trong 5 phút, 50oC trong 60 phút và 70oC trong 15 phút).
Hỗn hợp thành phần rtPCR cho thể tích 25 µl (1X dung dịch đệm, 2,8 µM MgCl2, 0,4 µM dNTPs, 0,2 µM EAV–Forward primer, 0,2 µM EAV–Reverse primer, 0,1 µM EAV-probeCy5, 0,2 µM CN-PRRS–Forward primer, 0,2 µM CN-PRRS – Reverse primer, 0,1 µM CN-PRRS –probeFAM, 0,1U/ µl Hot start polymerase, 5 µl DNA template và nƣớc không chứa nuclease cho đến 25 µl) đƣợc thực hiện theo chu trình nhiệt gồm chƣơng trình biến tính 95oC trong 15 phút, chƣơng trình khuếch đại lặp lại 44 lần (95o
C trong 30 giây, 60oC trong 30 giây, 72oC trong 30 giây), đọc tín hiệu huỳnh quang sau bƣớc kéo dài 72oC ở mỗi chu kỳ.
VẬT LIỆU PHƢƠNG PHÁP
Kết quả rtPCR đƣợc xem là dƣơng tính nếu các chứng âm (không có DNA mục tiêu) đều âm, chứng nội có giá trị Ct (Cy5) trong khoảng 33-35 và mẫu có giá trị Ct (FAM) ≤ 40. Ngƣợc lại, các mẫu đƣợc xem là âm tính nếu các chứng âm đều âm, chứng nội có Ct (Cy5) trong khoảng 33-35 nhƣng mẫu không thu đƣợc giá trị Ct (FAM) hay giá trị Ct (FAM)> 40. Các mẫu có giá trị Ct (FAM)> 38 cần đƣợc lặp lại kiểm tra để xác định kết quả 3 lần. Nếu chứng nội có giá trị Ct (CY5) nằm ngoài khoảng mong đợi và mẫu có giá trị Ct (FAM)> 40 hoặc không thu đƣợc giá trị Ct (FAM) thì kết quả xem nhƣ không xác định; trong trƣờng hợp này cần tách chiết DNA từ đầu và lặp lại phản ứng rtPCR.
II.2.1.2 Phân lập vi-rút
Một số mẫu mô và huyết tƣơng của heo cho kết quả dƣơng tính với RT-rtPCR khuếch đại gen nsp2 của vi-rút PRRS đƣợc dùng để phân lập vi-rút theo sơ đồ sau: Giai đoạn chuẩn bị
Cho 5 x 105 tế bào MARC-145 vào flask 25 cm2 Ủ ở 37o
C/ 3-5% CO2
VẬT LIỆU PHƢƠNG PHÁP
37
NTH-PPV:SS-PRRS: BÁO CÁO NGHIỆM THU 1/2013
Phân lập vi-rút
Bước 1: Nghiền 0.5 g mẫu mô trong 5ml PBS chứa 2x kháng sinh
Bước 2: Đổ dịch nghiền vào trong một ống falcon sạch
Bước 3: Ly tâm 2000 g trong 5 phút
Bước 4: Thu nhận dịch nổi trong một ống falcon sạch
Bước 5: Cho 1 ml dịch nổi vào flask 25 cm2
có 100% tế bào đơn đã chuẩn bị.
Bước 5: Ủ tại 37o
C/3-5% trong 24 h
Bước 7: Đổ bỏ môi trƣờng
Bước 8: Rửa tế bào với 10 ml PBS chứa 2x kháng sinh
Bước 9: Đổ bỏ PBS
Bước 10: Cho 10 ml môi trƣờng duy trì (MM) vào mỗi flask 25 cm2
.
Bước 11: Ủ tại 37o
C/3-5% trong 24 giờ
Bước 13: Kiểm tra hằng ngày để xác định Cytopathic Effect (CPE) và tế bào
chết do độc tố của mẫu trong 5 – 7 ngày.
VẬT LIỆU PHƢƠNG PHÁP
Môi truờng sử dụng
Môi trƣờng duy trì (Maintenance Media (MM – MARC145 cells) 500ml Eagles Minimum Essential Media (EMEM) 2% Foetal Calf Serum (FCS)
0,25% Penicillin/Streptomycin 2ug/ml Fungizone
10mM Hepes 1% Na Pyruvate 2mM Glutamine
0,5% Lactalbumin hydrolysate (LAH) Phosphate Buffered Saline (PBS)
8g NaCl 0,2g KCl
1,15g Na2HPO4 0,2g KH2PO4
(0,5% Penicillin/Streptomycin + 4ug/ml Fungizone)
II.2.1.3 Xác định ngưỡng phát hiện của phương pháp phát hiện RT PCR – PRRS (nps2)
Ngƣỡng phát hiện hay còn gọi là giới hạn phát hiện hay độ nhạy phân tích của phƣơng pháp là nồng độ thấp nhất của thành phần cần xác định trong mẫu đƣợc xác định một cách nhất quán, không định lƣợng, trong điều kiện phòng thí nghiệm với loại mẫu nhất định [54]. Ngƣỡng phát hiện là đặc tính quan trọng cần đƣợc xác định cho cả test định tính và định lƣợng. Biết ngƣỡng phát hiện của phƣơng pháp sẽ giúp hiểu đƣợc tại giới hạn nào phản ứng sẽ cho kết quả âm tính giả. Điều này
VẬT LIỆU PHƢƠNG PHÁP
39
NTH-PPV:SS-PRRS: BÁO CÁO NGHIỆM THU 1/2013
có thể đóng vai trò quan trọng trong quản lý dịch bệnh của virut gây bệnh có thể lây lan nhanh nhƣ PRRS.
Ngƣỡng phát hiện có thể đƣợc xác định bằng bằng cách: (1) sử dụng thống kê, (2) sử dụng thực nghiệm, thử nghiệm với dãy mẫu pha loãng với nồng độ đƣợc biết trƣớc của thành phần, loại mẫu cần xác định. Trong các xét nghiệm, ngƣỡng phát hiện thƣờng đƣợc xác định bằng phƣơng pháp thực nghiệm.
Để xác định ngƣỡng phát hiện của phƣơng pháp rtPCR, dãy nồng độ pha loãng có thể đƣợc chuẩn bị bằng cách xác định nồng độ vi-rút với phƣơng pháp plaque assay hay tạo dòng.
A. Xác định nồng độ vi-rút bằng phương pháp plaque assay
Để xác định độ nhạy của phản ứng RT-rtPCR dùng phát hiện PRRSV genotype Trung Quốc chúng tôi tiến hành thực hiện plaque assay để xác định nồng độ vi-rút trong mẫu ban đầu. Sau đó tiến hành pha loãng và tách chiết RNA vi-rút và thực hiện phản ứng RT-rtPCR để xác định ngƣỡng phát hiện. Plaque assay đựơc chúng tôi tiến hành theo sơ đồ ở trang bên.
VẬT LIỆU PHƢƠNG PHÁP
Hình II-2: Sơ đồ thực hiện plaque assay