Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.3. Biến nạp vi khuẩn mang gen AGPase vào mảnh lá mầm sắn KM
Để có nguyên liệu là mảnh lá mầm, tiến hành tạo mô sẹo từ đoạn thân và mảnh lá chưa trưởng thành sắn KM 94 cắt và đặt vào môi trường MS bổ sung Picloram nồng độ 12mg/l có VTM C và VTM mix (hình 8. A,B).
Sau khoảng 2 tuần các mẫu cảm ứng tạo mô sẹo và xuất hiện phôi (hình 8. C, D) Các mẫu chứa phôi được chuyền sang môi trường MS có bổ sung 1BAP (1mg/l) và AgNO3 nồng độ 3mg/l để phôi sơ cấp chuyển sang giai đoạn lá mầm (hình 8. E, F).
Lá mầm lớn lên, tiến hành biến nạp cũng tương tự các bước như khi biến nạp vào đoạn thân và mảnh lá chưa trưởng thành. Tách các lá mầm, cắt thành mảnh nhỏ, cảm ứng 2 ngày, đồng nuôi cấy trong 2 ngày. Sau đó đặt lên môi trường MS có bổ sung Picloram nồng độ 12mg/l, kanamycin nồng độ 50mg/l và cefotaxim nồng độ 250mg/l (hình 8.G). Theo dõi khả năng sống sót và sự biến đổi của mẫu sau 3 tuần chuyển.
Kết quả các mẫu chuyển gen thu được ở bảng 8. Tiến hành chuyển gen AGPase vào mảnh lá mầm với tổng số mẫu là 90. Số mẫu tương ứng với từng thí nghiệm là 30 và được lặp lại 3 lần.
Bảng 8. Kết quả theo dõi các mảnh lá mầm trên môi trường chọn lọc sau khi nhiễm với Agrobacterium tumefaciens
Mẫu mảnh lá chuyển gen
Mẫu sống sót sau nhiều
lần chuyển Mẫu tạo mô sẹo Số lượng Tỉ lệ (%) Số lượng Tỉ lệ (%) Số lượng Tỉ lệ (%)
39
Qua bảng ta thấy số lượng mảnh lá mầm chuyển gen sống sót trên môi trường chọn lọc là rất cao chiếm 93,7%. Như vậy số lượng mẫu có thể mang gen là rất lớn. Hầu hết số mẫu có khả năng sống sót trên môi trường chọn lọc đều có khả năng tạo mô sẹo với tỉ lệ rất cao gần như tuyệt đối (chiếm 96%) trong khi đó mẫu đoạn thân non chỉ đạt 75,4%. So với tất cả các loại vật liệu đã nghiên cứu có thể kết luận mảnh lá mầm chuyển gen có khả năng sống sót và tạo mô sẹo trên môi trường chọn lọc cao nhất, thích hợp cho nghiên cứu tạo cây chuyển gen.
A B C D
E F G
Hình 11. Kết quả chuyển gen AGPase vào mảnh lá mầm sắn KM 94
A: Đoạn thân non sắn KM 94 trên môi trường tạo mô sẹo
B: Mảnh lá chưa trưởng thành sắn KM 94 trên môi trường tạo mô sẹo
C, D Đoạn thân non, mảnh lá chưa trưởng thành sắn KM 94 cảm ứng tạo mô sẹo và phát sinh phôi sơ cấp
E, F: Phôi sơ cấp trên môi trường MS bổ sung BAP nồng độ 1mg/l và AgNO3 nồng độ 3mg/l chuyển sang giai đoạn phôi thứ cấp và hình thành lá mầm
40