Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Biến nạp vi khuẩn mang gen AGPase vào mảnh thuốc lá K
Sau khi đã nuôi khuẩn mang gen đích, tiến hành biến nạp vào mảnh lá thuốc lá K326 đã được cảm ứng 2 ngày trong môi trường MS có bổ sung BAP nồng độ 1mg/l. Sau khi biến nạp chuyển mẫu sang môi trường đồng nuôi cấy có bổ sung AS với nồng độ 200mg/l và để trong tối hai ngày. Sau hai ngày đồng nuôi cấy, tiến hành rửa khuẩn và cấy chuyển các mảnh lá sang môi trường chọn lọc (MS bổ sung BAP nồng độ 1mg/l, Kanamycin nồng độ 50mg/l và Cefotaxim nồng độ 250mg/l).
Thí nghiệm chuyển gen AGPase vào mảnh lá thuốc lá K326 được lặp lại 3 lần, mỗi lần với 70 mảnh lá nguyên liệu. Qua theo dõi số mẫu nhận thấy số lượng mô lá sống sót trên môi trường chọn lọc giảm dần theo thời gian (còn 45% mẫu sống sót sau 4 tuần).
Điều này cho thấy khả năng những mô lá tồn tại và phát triển được có thể là những mô đã được chuyển gen. Tuy nhiên, một số lượng lớn các mô sống sót và phát triển trên môi trường chọn lọc nhưng không cảm ứng tạo chồi tái sinh. Sau 10 ngày tại những vết cắt ở một số mảnh lá bắt đầu xuất hiện những cụm tế bào cứng, có màu xanh lá (hình 6.B).
Theo những nghiên cứu trước về quá trình tái sinh cây thuốc lá thì đây chính là tiền đề cho việc tái sinnh chồi [6]. Với 70 mảnh lá/ lần biến nạp (lặp lại thí nghiệm 3 lần) thu được trung bình 8,25 ± 2,12 mảnh lá có cảm ứng , đạt tỉ lệ khoảng 17,7 ± 2,1 (bảng 5). Tỉ lệ này thấp hơn so với chuyển gen vào giống thuốc lá C9 - 1 với 24,5% [6]. Chỉ 25% số mẫu tạo phôi phát triển chồi tái sinh cây. Từ 25% mẫu tạo chồi này thu được 14 cây chuyển gen, các chồi được tách và chuyển sang môi trường ra rễ cho cứng cáp đến khi sẵn sàng chuyển sang
30
trồng trong bầu (hình 6.C,D,E). Tiến hành thu mẫu lá của 14 cây chuyển gen đem phân tích sự có mặt của gen AGPase bằng phương pháp phân tích phân tử PCR.
Bảng 5. Kết quả theo dõi các mảnh lá thuốc lá trên môi trường chọn lọc khi nhiễm với Agrobacterium tumefaciens
Mẫu thuốc lá chuyển gen Mẫu sống sót sau 4 tuần Mẫu tạo phôi tái sinh cây
Số lượng Tỉ lệ (%) Số lượng Tỉ lệ (%) Số lượng Tỉ lệ (%)
210 100 90 ± 2,2 42,8 ± 2,5 8,25 ±2,12 17,7 ± 2,1
31
A B C
D E
Hình 7. Kết quả chuyển gen AGPase vào mảnh lá thuốc lá K326
A: Mảnh thuốc lá chuyển gen trên môi trường chọn lọc B: Mảnh lá thuốc lá tạo chồi trên môi trường chọn lọc C: Tách chồi chuyển sang môi trường ra rễ
D: Cây trồng trong môi trường ra rễ sẵn sàng cho ra bầu E: Cây thuốc lá chuyển gen trồng trong bầu
32
