Khi nhuộm vi khuẩn với thuốc màu Crystal Violet và một chất gắn màu Iodine, nếu ta tẩy màu bằng cồn 95%, có một số vi khuẩn vẫn giữ chặt màu tím của Crystal Violet, đó là nhóm Gram (+). Một số khác bị tẩy mất màu tím vì màng tế bào thiếu chất chuyên biệt dùng kết hợp với Crystal Violet, đó là nhóm Gram (-).
Khi nhuộm lại với dung dịch Safranin 0,5%, nhóm Gram (+) vẫn giữ màu tím, còn nhóm Gram (-) sẽ bắt màu đỏ.
3.2.2.Dụng cụ và thuốc nhuộm:
Dụng cụ
Khuyên cấy khuẩn.
Đèn cồn.
Kính đựng vật (lame) sạch.
Bút chì mở.
Chai nhỏ giọt đựng nước muối 0,85%
Đồng hồ phút.
Thuốc nhuộm
Dung dịch Crystal Violet.
Dung dịch Iodine.
Cồn 95%.
Dung dịch Safranin 0,5% hay dung dịch Carbon Fuchsin 1/10.
Mẫu thử làm phiến phết
Nếu là lứa cấy lỏng: tùy theo độ đục của lứa cấy, ta lấy 1 giọt nhỏ hay lấy đầy 2,3 khuyên cấy khuẩn để làm phiến phiết.
Nếu là lứa cấy trên môi trường đặc: dùng khuyên cấy khuẩn chấm 1 khóm vi khuẩn riêng rẽ, làm huyền trọc trong 1 giọt nước muối trên kính, xong trải mỏng thành phiến phết. Nên phân tán đều, không dầy, để có thể quan sát được từng tế bào vi khuẩn.
Kỹ thuật làm phiến phết.
Cầm que cấy thật thẳng đứng, đầu khuyên đặt trên ngọn lửa đèn cồn và đốt đỏ đầu que cấy.
Để nguội lấy 1 khuyên cấy đầy bệnh phẩm.
Đặt khuyên bệnh phẩm vào giữa tấm kính, cho áp suất vào mặt kính, phết đều trên kính thành những hình bầu dục với diện tích 1,5 x 2,5cm.
Đốt đỏ đầu que cấy để khử khuẩn.
Lưu định phiến phết
Phiến phết phải được để khô tự nhiên trong không khí, hoặc hơ nhẹ trên ngọn đèn. Sau đó, lưu định phiến phết bằng cách đưa nhanh tấm kính qua lại trên ngọn lửa độ 4 – 5 lần, để mặt có phiến phết ở phía trên. Không được hơ quá nóng sẽ làm các tế bào co lại.
Để nguội trước khi nhuộm và khoanh vùng bệnh phẩm bằng nút chì mở dễ tìm.
Kỹ thuật nhuộm
Phủ dung dịch Crystal Violet lên phiếm phết, để 1 phút. Rửa nước và nghiêng kính cho ráo.
Phủ dung dịch Iodine:
Lần I để 30 giây, đổ bỏ.
Lần II để 30 giây, đổ bỏ.
Phủ cồn 95% lên phiến phết, để 30 giây.
Rửa nước và nghiêng kính cho ráo. Quan sát phiến phết, nếu còn những vết màu tim đậm phải tẩy màu lần nữa.
Nhuộm lại với dung dịch Safranin trong 30 giây.
Rửa nước, để khô và khảo sát với vật kính dầu.
3.2.4. Kết quả
Theo phương pháp nhuộm Gram, vi khuẩn được phân biệt thành 2 nhóm:
Vi khuẩn Gram (+): giữ màu tím của Crystal Violet.
Vi khuẩn Gram (-): giữ màu đỏ của Safranin.
3.3.1. Nguyên tắc
Thuốc kháng sinh thấm trên đĩa, khuếch tán ra môi trường xung quanh ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn. Đường kính vùng bị chặn diễn đạt tính cảm ứng của vi khuẩn đối với thuốc kháng sinh, trường hợp không có vùng bị chặn, vì khuẩn kháng lại thuốc kháng sinh.
3.3.2. Chuẫn bị
Đĩa kháng sinh
Là những đĩa giấy có đường kính 6mm được tẩm một dung dịch thuốc kháng sinh với nồng độ tiêu chuẩn. Đĩa kháng sinh phải được giữ ở tủ lạnh, có kèm theo chất làm khan nước, chống ẩm sức nóng và sự ngoại nhiễm làm hỏng đĩa.
Môi trường
Môi trường tiêu chuẩn là MHA (Mueller Hinton Agar) pH: 7,4. Với các vi khuẩn khó tính phải cho thêm 5% máu.
Môi trường được đổ vào hộp Petri với bề dày của thạch là 4mm. Bảo quản ở tủ lạnh và không được dùng sau 7 ngày. Trước khi dùng, phải lấy ra khỏi tủ lạnh và để cho đến khi đạt được nhiệt độ phòng.
Dung dịch chuẩn độ đục.
Là dung dịch muối BaSO4
Dung dịch dự trữ A BaCl2.2H2O 11,7g ED qsb 1000ml Dung dịch dự trữ B H2SO4 1% Dung dịch chuẩn độ đục Dung dịch A 0,5ml Dung dịch B 99,5ml Vi khuẩn thử nghiệm
Vi khuẩn sau khi đã được cấy thuần khiết, cấy vào ống 2-5ml môi trường TSB (BHI) ủ 37oC trong 2-8 giờ để đạt được độ đục chuẩn của muối Barium Sulfate.
3.3.3. Kỹ thuật
Các bước thực hiện:
Chọn khúm vi khuẩn.
Làm huyền dịch vi khuẩn trong nước muối hấp vô khuẩn hay môi trường lỏng.
Dùng que gòn vô trùng nhúng vào huyền dịch vi khuẩn đã chuẩn bị và ép kiệt nước trên thành ống.
Trải đều vi khuẩn trên môi trường thạch. Thạch trên chuẩn thường dùng Mucller Hinton (MHA).
Dùng kẹp vô trùng lấy các đĩa kháng sinh gắn trên mặt thạch, mỗi hộp đặt khoãng 7-8 đĩa.
Ủ 37o
C và đọc kết quả sau 24 giờ.
Đo đường kính vòng khuẩn.
Đọc kết quả bằng cách so với bảng chuẫn.
Bảng 5: Một Số Tiêu Chuẩn Biện Luận Đường Kính Vòng Vô Khuẩn Và Điểm Gây Nồng Độ Ức Chế Tối Thiểu (MIC) Của Enterrobactorlaceae
Đĩa Kháng Sinh Mã (Code) Hàm Lƣợng Đƣờng kính vòng vi khuẩn đo bằng mm tròn Kháng Trung gian Nhạy Amikacin Ak 30µg ≤ 14 15-16 ≥ 17 Ampicillin Am 10µg ≤ 13 14-16 ≥ 17 Amoxlcallin Ax 10µg ≤ 13 14-16 ≥ 17 Amoxlcallin/clavuanic acid Ac 20/10µg ≤ 13 14-17 ≥ 18 CEPHALOSPORIN và CEPHEM khác Cephalexin Cp µg - 15-17 ≥ 18 Cefamandole Cd 30µg ≤ 14 15-17 ≥ 18 Cefepime Cm 30µg ≤ 14 15-17 ≥ 18
Cefoperazone Cf 75µg ≤ 15 16-20 ≥ 21 Cefuroxime Ct 30µg ≤ 14 15-22 ≥ 23 Cefutriaxone Cx 30µg ≤ 13 14-20 ≥ 21 Ceftazidime Cz 30µg ≤ 14 15-17 ≥ 18 Cefuroxime acetil Cu 30µg ≤ 14 15-22 ≥ 23 Cefaclor Cr 30µg ≤ 14 15-17 ≥ 18 Imipenem Im 10µg ≤ 13 14-15 ≥ 16 Gentamicin Ge 10µg ≤ 12 13-14 ≥ 15 Kanamycin Kn 30µg ≤ 13 14-17 ≥ 18 Netilmicin Ni 30µg ≤ 12 13-14 ≥ 15 Tobramycin Tb 10µg ≤ 12 13-14 ≥ 13 Streptomycin Sm 10µg ≤ 11 12-14 ≥ 15 Tetracycline Te 30µg ≤ 14 15-18 ≥ 19 Doxyciline Dx 30µg ≤ 12 13-15 ≥ 16 Ciprofloxacin Ci 5µg ≤ 15 16-20 ≥ 21 Norfloxacin Nr 10µg ≤ 12 13-16 ≥ 17
Ofloxacin Of 5µg ≤ 12 13-15 ≥ 16 Nalidixic acid Ng 30µg ≤ 13 14-18 ≥ 19 Trirnethoprim/sulfamethoxazole Bt 1,25/23,75µg ≤ 10 11-15 ≥ 16 Vancomycin Va 30µg ≥ 15 Chloramphenicol Cl 30µg ≤ 12 13-17 ≥ 18 Nitrofurantoin Fr 300µg ≤ 14 15-16 ≥ 17 Penicicllin ( dùng Oxacllin) Ox 1µg - - ≥ 20 Clindamycin cL 2µg ≤ 14 15-20 ≥ 21 Erythromycin Er 15µg ≤13 14-22 ≥ 23
4.1. Cách pha chế một số môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn
Môi trường là những thức ăn để nuôi cấy vi khuẩn. Môi trường phong phú đối với vi khuẩn là môi trường giúp cho các vi khuẩn tăng trưởng mạnh và nhanh. Muốn được như thế, môi trường phải hội đủ các điều kiện sau đây:
Giàu chất dinh dưỡng thích hợp: nito, carbon, protid, acid amine, muối khoáng, yếu tố tăng trưởng.
Điều kiện vật lý thuận lợi: nhiệt độ, pH, áp lực thẩm thấu.
Có nhiều cách phân loại môi trường. Theo dinh dưỡng và cách sử dụng, môi trường được chia làm 6 nhóm:
Môi trường dinh dưỡng cơ bản.
Môi trường bổ.
Môi trường chuyên chở.
Môi trường phong phú.
Môi trường phân lập.
Môi trường định danh hay môi trường sinh hóa.
4.1.1. Môi trƣờng dinh dƣỡng cơ bản.
Điều chế nước thịt
Nước thịt tốt, phải trong. Muốn đạt được kết quả này cần phải có những điều kiện:
Chọn thịt bò tơ.
Lọc hết mỡ gân.
Thịt không bị đông ở tủ lạnh.
Xay thật nhỏ.
Cân và thêm nước cho đúng.
Để ở tủ lạnh từ 17-20 giờ. Dụng cụ
Dao, thớt, máy xay thịt, nồi đựng thịt (bằng inox, không rỉ), giá múc thịt, nước lọc, ống đong nước, vải lọc, giấy lọc, phểu.
Cách làm
1kg thịt bò lọc hết mỡ, gân, cắt miếng nhỏ, đem xay nhuyễn. Cho thịt vào nồi, đong nước (đã để lạnh một đêm) theo tỉ lệ:
Thịt xay nhuyễn 500g
Nước cất 1000ml
Khuấy đều, đậy nắp nồi. để vào tủ lạnh 17-24 giờ. Ngày hôm sau, lấy ra, đun từ từ lên 100oC, để sôi 30 phút. Lắng 5 phút, lọc. Nên lọc qua vải ướt và 2 lớp giấy lọc để tránh màng mở trên mặt. Trước khi lọc, nhét ít bông thâm nước vào lổ trên của ống phễu để giấy lọc không bị rách. Cho vào chai hấp 121oC trong 15 phút.
4.1.1.1. Canh thang
Là môi trường căn bản của vi khuẩn học, màu vàng nhạt. Thành phần gồm có: nước thịt, peptone, và NaCl.
Nước thịt 600ml
Peptone Martin 500ml
NaCl 0,5g
Đun sôi cho tan, điều chỉnh PH 7,4 bằng NaOH 10%, hấp 121oC trong 30 phút. Ngày hôm sau gạn lấy nước trong, lọc qua giấy lọc ướt nhiều lần, phân phối vào ống nghiệm hay cầu bình, hấp 110o
C trong 10 phút. 4.1.1.2. Thạch thường Nước thịt 500ml Peptone Martin 500ml NaCl 0,5g Thạch 20g
Cho thạch vào hỗn hợp nước thịt, pepetone bột, muối, đun sôi cho tan đều, chỉnh pH = 7,4. Cho vào một bình thành thẳng đứng đem hấp 121oC trong 30 phút. Ngày hôm sau cắt bỏ phần cặn ở dưới, lấy phần thạch trong còn lại cắt nhỏ, đun sôi, lọc qua vải hay bông gòn khi còn nóng, phân phối vào ống nghiệm 19x150, 7ml mỗi ống. Hấp 110oC trong 15 phút, lấy ra để nằm nghiêng.
4.1.2. Môi trƣờng bổ.
Thạch máu
Là môi trường căn bản dùng phân lập và nuôi cấy các vi khuẩn khó tính.
Cao thịt bò 10g
Peptone 10g
NaCl 5g
Thạch sợi 20g
pH = 7,4
Cân các thành phần, hòa tan với 1 lít nước cât đun sôi, điều chỉnh pH = 7, 3. Hấp khử khuẩn 121oC trong 15 phút. Lấy ra để môi trường nguội 50oC, cho thêm 5% máu tươi (cừu, thỏ, người). Trộn đều phân phối ra hộp Petri vô khuẩn. Để nguội, lật ngược hộp thạch cất vào tủ ủ 37oC. Hôm sau lấy ra loại bỏ những hộp thạch ngoại nhiễm, những hộp còn lại cất vào tủ lạnh để dùng dần.
Môi trường T.S.A (Trypticase Soy Agar) Trypticase peptone 15g Phytone peptone 5g NaCl 5g Thạch sợi 15g pH =7,3
Cân 40g bột TSA hòa trong 1 lít nước cất, đun sôi cho tan. Hấp 121oC trong 15 phút.
Môi trường BHI
Dịch tũy bò con (Calf-Brain) 200g
Tim bò 250g
Peptone 10g
NaCl 5g
Disodium Phosphate (Na2HPO4) 2 ,5g
Hòa tan 37g môi trường khô vào 1 lít nước cất. Hấp khử khuẩnn121oC trong 15 phút.
4.1.3. Môi trƣờng chuyên chở
Môi trường Cary Blair
Dùng để chuyên chở hầu hết các loại bệnh phẩm.
Sodium thioglycollate 1,5g
Disodium Phosphate 1,1g
NaCl 5g
Thạch 5g
Hòa hỗn hợp trên vào 991ml nước cất đun sôi, khuấy cho tan. Để nguội 50oC, cho thêm 9ml dung dịch calcium chloride 1%, khuấy đều trong 2 phút. Điều chỉnh pH = 8,4 với NaOH.N hay HCl.N. Phân phối vào chai đặc biệt, mỗi chai 7ml. Sau đó hấp 110oC trong 15 phút.
4.1.4. Môi trƣờng phong phú hóa
Môi trường Tetrathionate lỏng
Dùng làm tăng sinh số lượng vi khuẩn Samonella shigella trong phân.
Tetrathionate căn bản
Proteose peptone 5g
Bacto-bile salts 1g
Sodium thiosulfate 30g
Dung dịch Iodine
Iodine 6g
Potassium Iodine 5g
ED 20g
Cân 46g môi trường khô tetrathionate hòa tan vào 1 lít nước cât, đun sôi. Để nguội lại 45oC, cho thêm 20ml dung dịch Iodine, trộn đều phân phối vào ống nghiệm vô khuẩn, mỗi ống 10ml. Không đun nóng sau khi thêm Iodine. Tetrathionate căn bản giữ ở tủ lạnh để lâu được nhiều ngày. Sau khi cho thêm Iodine vào môi trường chì dùng trong 1 ngày.
4.1.5. Môi trƣờng phân lập
Môi trường thạch MC (Mac Conkey Agar)
Dùng phân lập các vi khuẩn đường ruột ngăn chặn vi khuẩn Gram dương mọc
Peptone 17g Proteose peptone 3g Lactose 10g Bile Salt N:3 1,5g NaCl 5g Agar 13,5g Neuture red 0,03g pH = 8
Cân 50g môi trường MC khô hòa tan vào 1000ml nước cất. Đun sôi cho tan, điều chỉnh pH = 7,2, khử khuẩn 121o
C trong 15 phút. Lấy ra để nguội khoảng 50oC phân phối vào hộp Petri vô khuẩn chờ môi trường đặc lại, lật ngược hộp thạch để vào tủ 37oC.
4.1.6. Các môi trƣờng sinh hóa khác
Môi trường Chapman
Dùng định danh tụ cầu khuẩn
Proteose peptone 10g Beef Extract 1g Mannitol 10g NaCl 75g Agar 20g Phenol Red 0,025g
Cân các chất theo công thức. Hòa tan vào 1 lít nước cất đun sôi cho tan. Điều chỉnh pH = 7,4 phân phối vào ống nghiệm 16 x 125ml, mỗi ống 3ml. hấp khử trùng 121oC trong 15 phút. Lấy ra để nghiêng.
Môi trường căn bản Decacboxylase (Decacboxylase medium base)
Peptone 5g
Yeast Extract 3g
Dextrose 1g
Brom cresol purple 0,02g (2ml dung dịch 1%)
pH = 6,5
Cân 9g hỗn hợp trên hòa tan vào 1 lít nước cất. Đun sôi cho tan, thêm L.Lysine, L.Arginine, L.Ornithine theo tỉ lệ 0,5%. Đun sôi điều chỉnh pH = 6,5 → phân phối vào ống nghiệm 19 x 150mm, mỗi ống 5ml môi trường. Hấp 121oC trong 15 phút.
4.2. Yêu cầu pha chế
Cân đúng chính xác từng thành phần.
Tránh lây nhiễm từ môi trường bên ngoài.
Phần 3:
KẾT QUẢ VÀ
THẢO LUẬN
1. Hình dạng khuẩn lạc trên môi trƣờng BA và MC
MC BA
Không thấy xuất hiện khuẩn lạc Hình dạng Tròn, lồi Màu sắc Trắng đục Hình thức Đứng theo theo từng chùm, hình dạng giống chùm nho Biện luận
Mục đích chính của việc cấy máu trên môi trường MC và BA:
Xem hình dạng khuẩn lạc.
Xác định cầu khuẩn hay trực khuẩn.
Hình 3.1: Hình dạng khuẩn lạc trên môi trƣờng MC và BA 2. Nhuộm GRAM
Sau khi tiến hành các bước nhuộm Gram mẫu theo qui định, ta tiến hành soi mẫu dưới kính hiển vi điện tử 100x.
Kết quả:
→ Cầu khuẩn Gram (+)
Hình 3.2: Hình ảnh khuẩn lạc dƣới kính hiển vi quang trƣờng 100x
3. Định danh Staphylococcus aureus
Thử nghiệm Kết quả
Catalse (+)
Oxidase (-)
SAULATEX (+)
Hình 3.4: Dung dịch thuốc thử SAUlatex và thử nghiệm SAUlatex (+)
4. Kết quả kháng sinh đồ mẫu máu
Bảng 6: Tổng kết số liệu kháng sinh đồ trên 5 đĩa Đĩa Kháng Sinh Mã (Code) Hàm Lƣợng Đƣờng kính vòng vi khuẩn đo bằng mm tròn Kháng (R) Trung gian (I) Nhạy (S) Amikacin Ak 30µg 30 Ampicillin Am 10µg 1,5 Amoxlcallin Ax 10µg 17 Amoxlcallin/clavuanic acid Ac 20/10µg 30 CEPHALOSPORIN và CEPHEM khác Cephalexin Cp µg 21 Cefepime Cm 30µg 26 Cefoperazone Cf 75µg 28 Cefuroxime Ct 30µg 23 Cefutriaxone Cx 30µg 23 Ceftazidime Cz 30µg 9 Cefuroxime acetil Cu 30µg 23
Cefaclor Cr 30µg 23 Imipenem Im 10µg 27 Gentamicin Ge 10µg 27 Kanamycin Kn 30µg 23 Netilmicin Ni 30µg 29 Tobramycin Tb 10µg 25 Tetracycline Te 30µg 33 Doxyciline Dx 30µg 34 Ciprofloxacin Ci 5µg 31 Norfloxacin Nr 10µg 30 Ofloxacin Of 5µg 31 Nalidixic acid Ng 30µg 2 Trirnethoprim/sulfamethoxazole Bt 1,25/23,75µg 3.2 Chloramphenicol Cl 30µg 26 Penicicllin Pn 10 units 0,7 Clindamycin cL 2µg 23
Erythromycin Er 15µg 1,2 Piperacillin Pt 100µg 26 Pefloxacin Pf 5µg 30 Neomicin Ne 30µg 25 Colistin Co 10µg 0,4 Levofloxacin Lv 5µg 39
Bệnh viện Đa Khoa Khu Vực Hồng Ngự là một bệnh viện có uy tín và trách nhiệm cao trong công tác y tế phục vụ nhu cầu đảm bảo sức khỏe cho người dân. Bệnh viện có một cơ sở trang thiết bị đầy đủ và hiện đại phục vụ tốt cho công tác y tế, bên cạnh đó với một đội ngũ các cán bộ y tế có trách nhiệm và năng lực cao, Bệnh Viện Đa Khoa Khu Vực Hồng Ngự luôn là một trong những bệnh viện có hiệu quả và đạt được nhiều thành công lớn, và luôn là chổ dựa vững chắc cho người dân.
Trong quá trình thực tập và trực tiếp tham gia làm việc tại phòng Vi Sinh là khoảng thời gian giúp em có được những bài học kinh nghiệm và bổ ích, và cũng giúp em