2. Vật liệu và phương pháp
2.2.1.2. Tiến hành
- Các đoạn mồi dùng trong phương pháp (phụ lục bảng 6.1)
- Hỗn hợp PCR có thể được chuẩn bị ngay trước khi tiến hành thí nghiệm, bổ sung DNA bộ gene; một cách khác là chuẩn bị dung dịch mẹ, chia nhỏ và trữở -200C cho đến khi sử dụng.
Cần phải sử dụng Qiagen Hotstart Taq Polymerase kit có chứa dung dịch Q. Dung dịch này có chứa betaine, là tác nhân xúc tác cho PCR xảy ra và ức chế sự hình thành các sản phẩm phụ tạo nên thang các sản phẩm khi điện di mẫu.
- Thành phần phản ứng Chất phát huỳnh quang
Hình 2.1: Một ví dụ tiêu biểu cho giai đoạn khuếch đại sản phẩm.
Khuếch đại vị trí ETR-B, trong đó mồi PCR bắt cặp với trình tự DNA đặc trưng ở biên và khuếch đại đoạn lặp lại, tạo ra sản phẩm PCR 292bp. DNA của M.tuberculosis H37Rv có 3 lần lặp lại đoạn trình tự lặp 57bp, và thêm 8 bpở vùng đầu các đoạn lặp lại.
- Điều kiện phản ứng
Bảng 2.3 :
Chương trình phản ứng trong máy luân nhiệt
950C 15 phút 950C 1 phút 550C 1 phút 30 chu kỳ 720C 1 phút 720C 10 phút 2.2.2. Điện di mao quản
9 Mục tiêu sử dụng kỹ thuật điện di mao quản trong kỹ thuật định kiểu gene dựa trên VNTR - MIRU
Cần có độ tin cậy của trong khoảng định lượng kích thước 75-500bp
Phân giải đến mức khác biệt 1bp - 350bp để có thể phát hiện các allele có khác biệt nhỏ
Bảng 2.2 : Thành phần PCR trong phương pháp MIRU - VNTR
Thành phần phản ứng Nồng độ dung dịch mẹ Nồng độ thành phần phản ứng Thể tích 1 phản ứng (μl) DNA bản mẫu 15 ng/μl 15 ng 1 Dung dịch đệm (HotStart) 10 X 1 X 2 Mồi F (gắn màu) 4 pmol/μl 0,4 μΜ 0,4 Mồi R 20 pmol/μl 0,4 μΜ 0,4 dNTPs (HotStart) 10 mΜ 0,2 mM 0,4 Q-solution 5 X 1 X 4 MgCl2 (HotStart) 50 mM 1,5 mM 1,5 Taq (HotStart) 5 U/μl 0,75 U 0,15 Nước ELGA 9,2 Tổng cộng 18
Hình 2.2: Quy trình thực hiện điện di mao quản bằng máy ABI 3130xl
1. Nạp mẫu: Nạp hỗn hợp các sản phẩm PCR đã đánh dấu 2. Phân tách: dựa trên kích thước sản phẩm
3. Phát hiện: dựa trên sự phân tách màu các huỳnh quang phát ra 4. Diễn giải: nhờ phần mềm GeneMapper
2 1 Ố ng mao qu ả n CCD panel, kính lọc spectrograph 3 4
Phân biệt các màu rõ rệt giữa các thuốc nhuộm khác nhau để tránh sự pha trộn màu giữa 4-5 màu khác nhau
Độ chính xác về định lượng kích thước các mẫu khác nhau cho phép so sánh thang chuẩn với các mẫu khác
9 Nguyên tắc điện di mao quản bằng hệ thống DNA analyzer 3130xl Applied Biosystem Inc.
Các đoạn sản phẩm trong mỗi nhóm PCR được nhuộm với 3 loại màu khác nhau, cùng với thang chuẩn chứng nội nhuộm bằng loại màu thứ 4, sau đó được phân tích cùng trong ống điện di mao quản trên máy giải trình tự DNA sequencer theo phương pháp định kích thước.
Một loại thuốc nhuộm sẽ được gắn vào một mồi trong cặp mồi bằng liên kết cộng hoá trị, mỗi cặp mồi trải qua phản ứng khuếch đại sẽ sản sinh sản phẩm với kích thước đặc trưng và mang theo thuốc nhuộm chuyên biệt . Thuốc nhuộm sẽ bị kích thích bởi ánh sáng bước sóng 488 nm, nhưng các loại thuốc nhuộm khác nhau sẽ phát
ra huỳnh quang khác nhau. Thiết bị phân tích bước sóng ở các độ dài sáng nhau sẽ giúp khẳng định sự tồn tại của từng loại huỳnh quang, kích thước sản phẩm mang huỳnh quang. Kỹ thuật này giúp phân tích các đoạn DNA có trùng kích thước phân tử nhưng có nguồn gốc khác nhau, chúng được nhuộm các màu khác nhau.
9 Cách tiến hành thao tác mẫu và thu nhận dữ liệu
Mỗi giếng chứa 1 uL từng loại sản phẩm PCR và 0,3 uL thang ROX 1000 và 10 uL HiDi formamide
Khi từng giếng trong đĩa 96 đã được bổ sung đầy đủ các thành phần, vortex đĩa và spin down (<1500 g trong 5 giây)
Gia nhiệt lên 950C trong 5 phút Lập tức đặt đĩa vào đá trong 2-5 phút Vortex đĩa và spin down
Đặt đĩa vào máy và bắt đầu khởi động chương trình 'Data collection' để thu nhận dữ liệu thô với matrix set DS 30 (gồm bộ màu 6-FAM (xanh dương), HEX (xanh lá), NED (vàng), ROX (đỏ, thang chuẩn)
Chương trình nhận diện các đỉnh biểu hiện cho sự xuất hiện của sản phẩm đích Kính lọc hỗ trợ sự phân tách màu phát ra từ sản phẩm đích
2.2.3. Xử lí thông tin thu nhận được
- Đánh giá chất lượng dữ liệu thô
Trục Y biểu diễn đơn vị huỳnh quang một cách tương đối (relative fluorescence units, RFUs). Trục X biểu diễn số lần ghi lại kết quảđọc huỳnh quang.
Đỉnh cần phải nhọn, rõ ràng và nằm trong khoảng 150-4000 RFU Tín hiệu nền cần phải thấp gần mức 0
- Thang chuẩn: MapMarker 1000 (X-Rhodamine labeled) (BioVentures, Inc.) Thang chuẩn bao gồm 23 mạch DNA đơn gắn một màu huỳnh quang, trong đó kích thước các thang lần lượt như sau: 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 475, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 base pairs.
Cường độđỉnh của từng thang phải lớn hơn 200 rfu (relative fluorescence units) - Các thông số phân tích:
Để không đọc nhầm tín hiệu nhiễu do primer có gắn mồi cần phải đọc kết quả từ scan number (trên trục X) thứ 1000 trởđi
Cường độ tối thiểu đểđược xác nhận là đỉnh thực sự của 1 thang là từ 150 rfu trở lên
- Phân tích dữ liệu:
Số lần lặp lại = (Kích thước sản phẩm khuếch đại – Kích thước đoạn biên) / Kích thước đoạn lặp lại
- Dữ liệu VNTR được nhập vào phần mềm BioNumerics (v4.0, Applied Maths), phân tích như là biến số gián đoạn (mỗi allele có số lần lặp các đoạn lặp lại liên tục khác nhau)
- Phân tích sự tương đồng giữa kiểu gene các chủng tạo thành nhóm dựa trên hệ số tương đồng Pearson Linear Correlation và cách vẽ cây tương đồng UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean). Đây là những thông số phù hợp cho bản chất sinh học tiến hóa theo từng bước mất hay thêm các đoạn lặp lại trình tự lặp (1).
3. Kết quả
3.1. Tối ứu hóa một sốđiều kiện phản ứng trong phương pháp VNTR – MIRU định kiểu gene các chủng Mycobacterium tuberculosis phân lập tại Việt Nam
9 Tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR
Hình 3.1: Kết quả PCR khác biệt gradient nhiệt độ bắt cặp mồi Iw-07 & Iw-08
Sản phẩm chính tại các nhiệt độ lai (1) 65, (2) 63, (3) 59, (4) 55, (5) 53, (6) 50 độ C (T2) thang 1kbp; (T1) thang 100bp
PCR cho kết quả âm tính tại các nhiệt độ lai 65, 63 độ C cho thấy những nhiệt độ này quá ngặt nghèo để phản ứng có thể xảy ra. Tại nhiệt độ 53, 50 độ C vạch sản phẩm chính khoảng 500bp lẫn với các vạch sản phẩm phụ gồm có primer dimmer và các sản phẩm không chuyên biệt. Tại nhiệt độ 55 cho sản phẩm nhiều, các vệt sản phẩm phụ ít.
Nồng độ MgCl2 là nhân tố chủ yếu ảnh hưởng đến hiệu quả hoạt động của Taq DNA polymerase. Các thành phần phản ứng, bao gồm bản mẫu DNA, các chất phức có mặt trong mẫu (như là EDTA hay citrate), dNTPs và proteins có thểảnh hưởng đến lượng Mg tự do trong hỗn hợp phản ứng. Thiếu lượng Mg cần thiết Taq DNA polymerase sẽ bị bất hoạt. Ngược lại, quá nhiều Mg tự do sẽ giảm độ hoạt động chính xác của enzyme làm tăng lượng sản phẩm khuếch đại không đặc hiệu. Vì những lí do đó rất cần thiết tối ưu hóa nồng độ MgCl2 cho từng PCR.
Đối với cặp mồi Iw-01 & Iw-02 bước khảo sát gradient nhiệt độ cho thấy sản phẩm phụ nhiều nên chúng tôi tiến hành chạy gradient nồng độ MgCl2 , sau đó chọn nồng độ 3,5mM để như là nồng độ cho ra sản phẩm PCR chấp nhận được.
Hình 3.2: Kết quả chạy điện di gradient nồng độ MgCl2 Iw-01, Iw-02
Nồng độ MgCl2: (1)1,5mM; (2) 2,0mM; (3) 2,5mM; (4) 3,0mM; (5) 3,5mM; (6) 4,0mM; (7) 4,5mM; (8) 5,0mM; (T1) thang 1kbp; (T2) thang 500bp
9 Điều chỉnh điều kiện chạy mẫu trong ống điện di mao quản máy DNA sequencer so với thông số mặc định chương trình chạy điện di mao quản (4)
Bảng 3.1: Các thông số nhiệt độ, cường độ dòng điện, điện thế dùng cho máy DNA sequencer khi phân giải mẫu
Nhiệt độ chạy mẫu 60 độ C Thể tích nạp mẫu vào ống mao quản 184 bước
Cường độ dòng điện tối đa 100 micro Amps Cường độ dòng điện hoạt động 100 micro Amps Dung sai điện thế 0,6 kVolts
Điện thế ban đầu 15 kVolts Thời gian chạy đầu 180 giây Điện thế nạp mẫu 1 kVolts Thời gian nạp mẫu 22 giây Điện thế chạy mẫu 15 kVolts Số lần đổi điện thế 10 Thời gian giữa 2 lần đổi điện thế 60 giây Thời gian nhận tín hiệu 1 giây Thời gian chạy mẫu * 4000 giây
* thông số thay đổi so với mặc định của máy. Phải thay đổi thông số này do sản phẩm PCR trong thí nghiệm này (có thể lên đến 1kb), có kích thước lớn hơn so với khả năng phân tích mẫu thông thường của máy là khoảng 500bp.
X
Hình 3.4: Biểu diễn mẫu với 3 sản phẩm PCR được nhuộm 3 loại dye: xanh dương (FAM), xanh lá cây (HEX), đen (NED). X: hỗn hợp primer dimer
3.2. Đánh giá mức độ áp dụng của kỹ thuật định kiểu gene dựa trên VNTR-MIRU MIRU
Chín mươi lăm mẫu trong nghiên cứu được rút ra trên tập hợp 450 mẫu của bệnh nhân lao màng não, lao phổi từ khắp các địa bàn Tp Hồ Chí Minh trong khoảng thời gian 2000 – 2004, trong đó bao gồm 35 M.tb kiểu gene Beijing, 18 M.tb kiểu gene Việt Nam được rút ra ngẫu nhiên, tỉ lệ các thành phần tương xứng với thành phần kiểu gene tập hợp 450 mẫu, trong đó có khoảng 37% là M.tb kiểu gene Beijing, 20% M.tb kiểu gene Việt Nam (nhánh nhỏ của họ Indo-Oceanic).
PCR được thực hiện trên 31 loci, chia thành 16 nhóm trên 95 mẫu, và lặp lại trên 10 mẫu để kiểm chứng độ lặp lại cao của thí nghiệm. Tuy đây là một khối lượng công việc lớn, nhưng nhờ công đoạn cuối có thể tiến hành bằng máy giải trình tự tự động DNA analyzer tiến hành đọc 1 lần 16 mẫu nhờ 16 đầu mao quản đã giúp công việc của nguời thao tác được giảm lược nhiều.
Hình 3.5 biểu diễn sự phân bố số chủng thuộc các allele trên từng locus, sự phân nhóm biểu hiện 3 nhóm chính:
[A]: nhóm có nhiều loại allele (số loại allele lớn hơn 5) và có 1 allele trội (số chủng thuộc allele đó lớn hơn 35 trong số 95 chủng). Kết quả PCR cho thấy khả năng sử dụng tính đa hình tại những vị trí này để sàng lọc
[B]: nhóm nhiều loại allele phân bố đồng đều. Kết quả PCR tại những vị trí này cho thấy tính đa hình cao
[C]: nhóm ít các allele (số loại allele nhỏ hơn 5). Kết quả PCR tại những vị trí này không đa dạng, phản ảnh tính đa hình thấp trên quần thể mẫu này
Hình 3.5: Đồ thị biểu diễn phân bố số chủng thuộc các allele trên từng locus Locus Số lần lặp lại của các trình tựlặp A B B A A
A B C A C C
C
C
C
A
B C C C C C
C A C C C A A
3.2.1. Khả năng định kiểu gene (Typability):
Khả năng định kiểu gene của kỹ thuật là phần trăm các chủng vi khuẩn dương tính khi thử nghiệm trên từng dấu hiệu sinh học.
Bảng 3.2: thống kê khả năng định kiểu gene của kỹ thuật trên một số dấu hiệu sinh học có xuất hiện kết quả âm tính. Locus 2059 3007 2165 2461 577 1955 2163a 3820 4120 Số mẫu cho kết quả âm (n= 95) 1 1 11 87 2 1 2 1 1 Typability(%) 98,92 98,92 88,17 6,45 97,85 98,92 97,85 98,92 98,92
Kết quả cho thấy dấu hiệu sinh học ở loci 2461 với khả năng định kiểu gene quá thấp trên quần thể mẫu này không thể sử dụng cho các nghiên cứu xa hơn tại đây.
Bàng 3.3: Một số lỗi kĩ thuật thường gặp ở phương pháp VNTR – MIRU
Hiện tượng Giải thích Cách khắc phục Hiện tuợng nhiễu
nhiều màu trong khoảng đọc 0-90 bp đầu tiên Sự tạo thành primer dimer, các primer gắn màu bắt cặp với nhau Khi đọc kết quả bỏ qua phần 0 – 90 bp đầu tiên Tín hiệu nhiễu và stutter peaks
Sự khuếch đại không hoàn toàn các trình tự lặp có thẻ phát sinh nhiều sản phẩm phụ với kích thuớc nhỏ hơn sản phẩm chính bằng vài trình tự lặp lại Sản phẩm khuếch đại thật sự cần tìm chính là sản phẩm lớn nhất. Cần loại bỏ tất cả những peak có chiều cao nhỏ hơn 32% peak trong loại sản phẩm chính phụ khuếch đại được Peak đôi Xuất hiện khi lượng sản phẩm
khuếch đại quá nhiều
Sản phẩm khuếch đại thực là peak nhỏ, đứng sau peak lớn truớc đó khoảng 0 – 10bp
3.2.2. Độ lặp lại của kỹ thuật (Reproducibility)
Độ lặp lại của kĩ thuật định kiểu gene dựa trên phần trăm chủng vi khuẩn cho kết quả giống nhau bất kể số lần lặp lại thí nghiệm.
31 dấu ấn sinh học được khuếch đại lặp lại trên 10 mẫu trong tổng số 95 mẫu cho thấy không có sự khác biệt trong kết quả, chứng minh độ lặp lại cao trong khoảng thời gian thí nghiệm của kỹ thuật định kiểu gene trên các dấu ấn sinh học này.
3.2.3. Allelic diversity: Chỉ số phân biệt để tính độ đa dạng kiểu gene dựa trên từng vị trí VNTR
Bảng 3.4: thống kê giá trịđa dạng kiểu gene trên từng vị trí loci
Locus Alias Số lượng allele Khoảng dao động số lượng các đoạn lặp PIC cho tất cả các mẫu (n=95) PIC cho kiểu gene Beijing (n=35) PIC cho kiểu gene Việt Nam (n=18) 580 MIRU 4, ETR D 5 2 - 6 0,632 0,000 0,636 2996 MIRU 26 8 1 - 8 0,722 0,700 <0,1 802 MIRU 40 5 1 - 5 0,518 0,393 0,296 960 MIRU 10 5 2 - 7 0,649 0,302 <0,1 1644 MIRU 16 4 1 - 4 0,546 0,405 <0,1 3192 MIRU 31 7 1 - 9 0,539 0,348 <0,1 154 MIRU 2 5 3 - 8 0,177 0,202 <0,1 2531 MIRU 23 5 2 - 6 0,121 0,109 <0,1 4348 MIRU 39 4 1 - 4 0,502 0,434 <0,1 2059 MIRU 20 6 0 - 6 0,160 0,211 <0,1 2687 MIRU 24 2 1 - 2 0,480 0,056 <0,1 3007 MIRU 27, QUB-5 5 0 - 4 0,538 0,668 <0,1 2165 ETR A 8 0 - 7 0,862 0,668 0,654 2461 ETR B 5 0 - 7 <0,1 577 ETR C 12 0 - 16 0,839 0,780 0,451 424 Mtub04 6 1 - 7 0,630 0,426 <0,1 2401 Mtub30 3 2 - 4 0,504 0,460 <0,1 3690 Mtub39 4 1 - 4 0,630 0,454 <0,1 2347 Mtub29 2 3 - 4 0,476 0,108 <0,1 3171 Mtub34 3 2 - 4 0,519 0,382 <0,1 1451 QUB-1451 5 4 - 9 0,401 0,304 <0,1 1895 QUB- 5 4 - 9 0,401 0,304 <0,1
PICi là khả năng mang độđa dạng kiểu hình (Polymorphic Information Content) của dấu ấn sinh học i
Pij là tần suất của dạng j xác định nhờ dấu ấn sinh học i trên tổng số n dạng nhận danh được
1895 1955 Mtub21 9 3 - 12 0,693 0,653 0.512 4156 QUB- 4156 4 4 - 7 0,621 0,459 <0,1 2163a QUB- 11A 15 4 - 19 0,862 0,705 <0,1 2163b QUB-11B 10 3 - 14 0,742 0,694 <0,1 3336 QUB-3336 9 6 - 16 0,516 0,211 <0,1 3232 QUB- 3232 13 1 - 16 0,645 0,676 0,704 3820 VNTR 3820 15 0 - 20 0,852 0,762 0,444 4052 QUB-26 9 0 - 9 0,741 0,518 0,500 4120 VNTR 4120 8 7 - 14 0,700 0,756 <0,1
* Những loci được tô vàng cho thấy HGI cao, từ 0,6 trở lên, đạt yêu cầu cho độ phân giải tốt; những loci được tô xám cho thấy HGI cao nhất.
Những loci với độ đa dạng cao nhưng vẫn có mức độ ổn định nhất định, đủ để làm marker phân biệt giữa các chủng, đặc biệt là bên trong M.tb kiểu gene Beijing và Indo-Oceanic (Việt Nam):
Các loci 2996, 2165, 577, 2163a, 2163b, 3820, 4120 cho thấy khả năng biểu thịđộđa dạng cao (lớn hơn hoặc bằng 0,7), có thể được áp dụng để phân biệt các chủng có mối liên hệ di truyền gần.
VNTR 3232 có thể dùng để phân biệt các M.tb kiểu gene Việt Nam trong họ Indo- Oceanic.
3.2.4. Độ phân giải của kỹ thuật (Discriminatory power)
Độ phân giải của một kỹ thuật định kiểu gene dựa trên khả năng phân biệt các chủng không có mối liên hệ di truyền với nhau, xác định bằng các chủng được nhận diện bằng kỹ thuật đang đánh giá và tần số tương đối của các chủng này. Chỉ số độ đa