1. Tổng quan tài liệ u
1.2.Các kĩ thuật sinh học phân tử xác định kiểu gene vi khuẩn lao
1.2.1. Các kĩ thuật sinh học phân tử phổ biến hiện nay trong tình hình nghiên cứu tại Việt Nam (12)
Các phương pháp định kiểu gene được phát triển để nghiên cứu sự lan truyền và động học quần thể vi khuẩn (5) trong các điều kiện lâm sàng và sinh thái, không chỉ xét trên phương diện tồn tại trong một vật chủ mà còn xét đến toàn bộ hệ sinh thái toàn cầu nói chung.
Mặc dù bộ gene của phức hợp M.tuberculosis có tính bảo tồn tuơng đối cao so với các tác nhân vi khuẩn khác, chủng đơn hình này vẫn có những vùng đa hình trong bộ gene, đó có thể là những đơn vị lặp. Có 2 dạng đơn vị lặp, các đoạn lặp phân bố rải rác (interspersed repeats: direct repeats, insertion sequence – like repeats) và các đoạn lặp liên tục (tandem repeats , head-to-tail direct uninterrupted repeats). Spoligotyping (27)
Vị trí lặp lại (The direct-repeat, DR, locus) là một vị trí trên chromosome chứa 10-50 đoạn sao chép của vùng lặp lại 36bp, các đoạn sao chép phân cách nhau bởi các đoạn giữa có trình tự thay đổi, kích thước trong khỏang 37-41bp. Các chủng
Mycobacterium tuberculosis có thứ tự sắp xếp các đoạn giữa giống nhau, nhưng khác nhau trên sự tồn tại hoặc biến mất của một sốđoạn giữa nhất định. Kỹ thuật định trình tự đoạn giữa (spacer oligonucleotide typing - spoligotyping) liên quan đến PCR tại vị trí DR,sau đó thực hiện phản ứng lai giữa sản phẩm PCR có đánh dấu và 43 oligonucleotide gắn trên màng và có trình tự tương hợp với từng đoạn giữa.Từng chủng riêng biệt cho tín hiệu âm hoặc dương đối với sự biến mất hoặc tồn tại của các đoạn giữa nhất định.
giữa như các dấu ấn sinh học làm cơ sở cho phương pháp spoligotyping. Tiếp theo hình vẽ minh hoạ sự tồn tại khác biệt các đoạn giữa nhất định trong 3 chủng M. bovis Calmette– Guérin (BCG), M. tuberculosis H37Rv, và chủng giả định M. tuberculosis X. Phần cuối minh họa spoligotypes của 3 chủng
IS6110 – RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
Trình tự chèn là một thành phần di truyền linh động, thường nhỏ hơn 2,5 kb,thường được phân bố rộng rãi trong bộ gene hầu hết các vi khuẩn. Trình tự chèn thường mang thông tin di truyền liên quan sự chuyển vị, điều hoà. Sự chuyển vị của các nhân tố chèn thường gây ra các đứt gãy trình tự gene, làm hoạt hoá hoặc thay đổi sự biểu hiện của các gene tiếp theo do sự liên hệ với các trình tự điều hoà như promoter, trình tự đích của các protein. M.tuberculosis sở hữu một trình tự chèn đặc trưng IS6110, dài khoảng 1355 bp. Số lần lặp lại IS6110
trên bộ gene các chủng khác nhau có thể dao động từ , 0 – 26 bản sao. Năm 1993, van Embden và cộng sự đã chuẩn hoá phương pháp lai phân tích Southern blot dựa trên IS6110.
Hình 1.5: IS6110-RFLP
Hình vẽ minh họa chromosome của chủng giả định Mycobacterium tuberculosis X.
Kiểu gene M. bovis Bacille Calmette–Guérin (BCG), chủng phòng thí nghiệm M. tuberculosis H37Rv, và chủng X với cách xác định dựa trên dấu ấn sinh học gồm trình tự chèn IS6110 và Mycobacterial Interspersed Repetitive Units (MIRUs).
Mycobacterial DNA bị phân giải bởi enzyme cắt giới hạn PvuII. Probe IS6110 lai vào trình tự IS6110 tại vị trí bên phải vị trí cắt PvuII. Kích thước các đoạn lai tùy thuộc vào khoảng cách giữa các đoạn cắt PvuII.
Bảng 1.3: So sánh ưu và khuyết của 2 phương pháp định kiểu gene vi khuẩn lao thông dụng
Ưu điểm Khuyết điểm
IS611 0 – RFLP
‐Phương pháp chuẩn cho dịch tễ học phân tử các chủng trong phức hợp
M.tuberculosis; thường được áp dụng trong các nghiên cứu về tiến hoá, phân tích phả hệ, phát hiện các lỗi trong phòng thí nghiệm, nhiễm chéo
‐Do đã được sử dụng rộng rãi nên có phần mềm vi tính để xử lí, có nhiều dữ
liệu để so sánh
‐Đồng hồ sinh học (mức độổn định của dấu ấn sinh học) đã được chứng minh đủ dài để làm nền tảng cho các nghiên cứu di truyền
‐Các dạng RFLP với hơn 6 đoạn chèn IS có độđa dạng nhất định
‐Màng có thể dùng lại để lai các loại probe khác nhau
‐Nhiễm hỗn hợp có thểđược phát hiện nhờ thay đổi cường độ tín hiệu lai
‐Cần phải cấy chuyền nhiều lần và tách chiết DNA
‐Quy trình phức tạp
‐Thời gian trả kết quả từ 30 – 40 ngày
‐Không thể tin tưởng vào độđa dạng của các dạng RLFP với ít hơn 6 đoạn chèn. ‐Có những chủng không có đoạn chèn IS6110 (dù rất hiếm) ‐Việc so sánh các dạng RLFP giữa các phòng thí nghiệm có thể thực hiện được nhưng phức tạp Spolig otypin g
‐Kỹ thuật đơn giản nhất đểđịnh kiểu gene các chủng M.tuberculosis
‐Số liệu được trình bày ở dạng nhị phân, cho phép so sánh dễ dàng dữ liệu trong phòng thí nghiệm và giữa các phòng thí nghiệm. Cơ sở dữ liệu SpolDB4 chứa dữ liệu của 40 000 chủng vi khuẩn lao từ hơn 120 nước.
‐Màng lai đã được phổ biến rộng rãi để phân tích đồng thời 45 mẫu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
‐Có thể tiến hành trực tiếp trên trên dịch đồng nhất mẫu,không cần tinh sạch DNA, hoặc trên vi khuẩn chết.
‐Độ phân giải không tốt bằng các phương pháp khác như IS6110 – RFLP
‐Không thể phân biệt đồng nhiễm
Không mang nhiều thông tin khi được áp dụng ở các vùng có chủng thống trị như W-Beijing ở Trung Quốc, Đông Nam Á, Nga.
1.2.2.Kĩ thuật dựa trên Variable Number of Tandem Repeats – Mycobacterial Interspersed Repetitive Unit (30)
9 Định nghĩa
Các trình tự lặp lại (tandemly repeated sequence) phân bố rải rác trong bộ gene, chúng có thể tồn tại ở bộ gene nhiều sinh vật, ngay cảở sinh vật bậc cao eukaryote . Các loại trình tự lặp:
Microsatellite: Đoạn lặp các trình tự ngắn từ 1-13bp Minisatellite: Đoạn lặp các trình tự từ 10-100bp
Mycobacterial Interspersed Repetitive Units (MIRUs): những đoạn DNA từ 40- 100bp, thường tồn tại ở dạng lặp và phân bốở các vùng không mã hoá (intergenic regions) trên bộ gene M.tuberculosis
Các dạng MIRUs: o Dạng 1: trình tự khoảng 77bp o Dạng 2: đặc trưng bằng đoạn chèn 24bp vào vị trí 3' và vị trí 5' của trình tự dạng 1 o Dạng 3: đặc trưng bằng đoạn chèn 15bp vào vị trí 3' và vị trí 5' của trình tự dạng 1 o Dạng hỗn hợp giữa dạng 2 và dạng 3 cũng có tồn tại, chứa cả 2 dạng đoạn chèn, như trong locus 8, 20
Hình 1.6: Vị trí của một số loci trên nhiễm sắc thể M.tuberculosis H37Rv. Những vị trí trong bộ gene biểu hiện sự siêu biến số lượng các trình tự lặp được gọi là vị trí đa
hình số lượng các trình tự lặp (Variable Number Tandem Repeat VNTR)
9 Giá trị của những dấu ấn sinh học này trong nghiên cứu tính đa hình và tiến hoá Kỹ thuật xác định dấu vân tay prokaryotes sử dụng dấu ấn sinh học VNTR ngày càng trở nên phổ biến. Mặc dù có nhiều nghiên cứu tìm hiểu cơ chế phân tử đa hình minisatellite ỏ người, quá trình điều hoà tính đa hình minisatellite ở vi khuẩn vẫn chưa được hiểu rõ. Đột biến ở minisatellite xuất hiện nhờ sự trượt của DNA polymerase (DNA slippage) trong quá trình sao chép DNA, thay đổi số lần lặp lặi các đoạn trình tự. Thành phần minisatellite của M.tuberculosis đã được hiểu khá rõ do chúng là một số vị trí đa hình trong bộ gene tương đối ổn định của M.tuberculosis. Từ những nghiên cứu trên các vị trí VNTR đã được hiểu rõ các đoạn lặp này cho thấy chúng tiến hoá bằng cách lần lượt giảm hoặc tăng số lần lặp lại các đoạn trình tự. Tác giả Grant (15) đề ra mô hình toán học để ước lượng khuynh hướng tăng giảm số lần lặp lại và tốc độ thay đổi. Đa số các vị trí cho thấy chúng có khuynh hướng giảm số lần lặp lại. Đột biến xảy ra tại các vị trí rất chậm chạp, vận tốc trụng bình khoảng 2,3 × 10−8, chậm hơn 350 lần so với tốc độ thay đổi ở vị trí VNTR với độ đa dạng tương tự quan sát được ởE.coli. Điều này cho thấy tập hợp thông sốđa hình các vị trí VNTR của một chủng M.tuberculosis sẽ là thông tin chỉ thị cho nguồn gốc di truyền và sẽ không sai khác giữa các chủng có liên hệ dịch tễ.
Tác giả Evgueni Savine (26) đánh khả năng ổn định tạm thời của các dấu ấn sinh học này bằng cách quan sát độ đa dạng của chúng qua 123 mẫu cấy chuyền nhiều lần trong thời gian 6 năm. Kết quả cho thấy 55 nhóm trong tổng số 56 nhóm có độ ổn định tốt, kết quả định kiểu gene không thay đổi. Nhờ đặc tính ổn định trong một khung thời gian nhất định, đa hình trên một số lượng cá thể, những dấu ấn sinh học này là những công cụ đắc lực để (i) theo dõi bệnh nhân nhiễm M.tb trong suốt thời gian dài, (ii) phối hợp cùng với phương pháp chuẩn lâu đời là IS6110 – RFLP để theo dõi các nhóm M.tb đang truyền dịch bệnh,(iii) nghiên cứu tiến hoá, từ phả hệ học (pedigree) đến các mối liên hệ tiến hoá lâu đời.