Tần suất của cấy truyền phụ thuộc vào điều kiện giữ giống và tuỳ thuộc vào lồi tảo. Thƣờng thì khi mật độ trong các bình lƣu giống cao (cĩ thể quan sát bằng mắt thƣờng) thì cĩ thể tiến hành cấy truyền.
San tảo sang một bình thuỷ tinh mới, bổ sung nƣớc và mơi trƣờng, vitamin tiếp tục lƣu giống bình thƣờng trong tủ làm mát.
Lưu ý: Nƣớc dùng để cấy truyền phải đƣợc khử trùng tốt, trƣớc khi cấy truyền cho vào tủ giữ giống cho nhiệt độ nƣớc và nhiệt độ bình lƣu giống cân bằng nhau. Sự chênh lệch nhiệt độ cĩ thể làm chết các lồi tảo giống.
2.3.3.4. Nguồn nước
Nƣớc cung cấp cho lƣu giữ giống vi tảo là nƣớc biển chứa trong bể cĩ nắp đậy, để lắng và đƣợc lọc qua ống lọc cĩ cỡ mắt lƣới lọc 1, nƣớc đƣợc đun sơi và để nguội.
2.3.3.5. Mơi trường dinh dưỡng
Hiện nay cĩ rất nhiều loại mơi trƣờng dinh dƣỡng dùng cho tảo, dƣới đây là một số mơi trƣờng dinh dƣỡng hay dùng cho tảo
Bảng 2.3. Thành phần các mơi trƣờng nuơi tảo
Thành phần dinh dƣỡng (g/l) Tên mơi trƣờng F/2 Conway MT3 NaNO3 0.075 Na2EDTA 4,36.10-3 6,6.10-3 Na2SiO3.5H2O 0.018 0,01 NaH2PO4.2 H2O 0.05 0,04 FeCl3.6 H2O 3.15.10-3 FeSO4 0,004 KOH 13,3.10-3 KNO3 13,3.10-3 0,4 CuSO4.5H2O 1.10-5 1,96.10-5 ZnSO4.5H2O 2,2.10-5 4,4.10-5 CoCl2.6H2O 1,1.10-5 2.10-4 MnCl2.4H2O 1,8.10-3 3,6.10-4 NaMoO4.2H2O 0,6.10-5 0,126.10-4 (NH4)6Mo7O24.4H2O 0,126.10-5 B12 0,1.10-3 0,5.10-4 B1 0,2.10-3 0,2.10-4 Biotin 0,1.10-5 0,01.10-5
Điều kiện nuơi
Tảo đƣợc nuơi trong các bình tam giác 250 ml, 500 ml và 1000 ml. Những dụng cụ nuơi cấy cùng với mơi trƣờng dinh dƣỡng trong tất cả các đợt nuơi cấy đều đƣợc khử trùng ở mức nhiệt độ 100o
C trong 20 phút.
Nguồn sáng đƣợc cung cấp bởi một giàn đèn gồm 4 bĩng Neon 40W với cƣờng độ ánh sáng là 50 mol.m-2.s-1. Chu kỳ quang là 10h/14h (sáng/tối).
Tảo đƣợc nuơi theo mẻ, tức là trong suốt quá trình nuơi cấy khơng cĩ bổ sung thêm hay lấy bớt đi chất dinh dƣỡng.
Hình 2.2. Lƣu giữ tảo giống
2.3.4. Nuơi sinh khối tảo làm thức ăn cho hầu bố mẹ, hầu giống và ấu trùng
2.3.4.1. Nuơi sinh khối bé trong phịng lạnh
* Điều kiện phịng nuơi sinh khối bé: Sử dụng phịng cĩ gắn điều hồ nhiệt độ
Điều chỉnh và duy trì nhiệt độ ổn định trong khoảng 20 – 22o
C. Chiếu sáng bằng đèn neon và sục khí liên tục 24/24.
* Phƣơng pháp nuơi:
Sử dụng nguồn giống lƣu để nuơi sinh khối bé.
Đƣa giống vào các bình thuỷ tinh hình cầu hoặc hình trụ cĩ dung tích từ 5 – 10lít. Cấp nƣớc biển đa qua khử trùng vào dung dịch tảo trên. Tuỳ theo mật độ tảo giống mà lƣợng nƣớc cung cấp khác nhau.
Cho mơi trƣờng dinh dƣỡng vào các bình nuơi theo tỷ lệ 1,5 - 1ml/l nƣớc, cĩ thể dùng mơi trƣờng F2 hoặc Colway.
Lưu ý: Khi nuơi tảo Chaetoceros cần cho thêm 0,5ml/l Silicas natri (Na2SiO3). Riêng với các lồi tảo xanh nhƣ: Chlorella sp., Tetraselmis sp. Nanochrolopsis aculata sử dụng mơi trƣờng dinh dƣỡng là Spemat (chất gây tảo) hay nƣớc cá thì tảo phát triển tốt
Sau khi nuơi 1 -2 ngày ta cĩ thể thu đƣợc tảo cĩ mật độ cao. Liên tục cấy truyền để thu đƣợc mật độ cao nhất trƣớc khi đem ra nuơi sinh khối lớn.
2.3.4.2. Nuơi sinh khối ngồi trời
Đây là cơng đoạn rất quan trọng nhằm cung cấp đầy đủ lƣợng thức ăn cho ấu trùng trong quá trình ƣơng giống.
Tảo đƣợc nuơi trong các túi nilong, thùng nhựa 120lít hoặc bể cĩ dung tích 1m3
trở lên.
Nguồn nƣớc: Nƣớc và chất lƣợng nƣớc là yêu cầu quan trọng cung cấp cho nuơi sinh khối tảo. Nƣớc đƣợc để lắng trong các ao chứa hoặc bể chứa 100 – 200m3, lọc thơ qua cát mịn và sau đĩ lọc tinh qua ống lọc.
Ánh sáng: Thƣờng sử dụng ánh sáng mặt trời, cƣờng độ chiếu sáng thích hợp từ 4.000 – 5.000 lux.
* Lƣu ý: Trong điều kiện thời tiết xấu, mƣa kéo dài chúng ta cĩ thể sử dụng bĩng đèn tuýp để chiếu sáng cho tảo. Thời gian phát triển của tảo kéo dài 4 – 5 ngày trong điều kiện nhiệt độ 20 – 24o
C.
Vào mùa hè nhiệt độ cao 29 – 30oC tảo phát triển nhanh nhƣng chĩng tàn. Vì vậy cần nuơi tảo trong nhà cĩ mái che, thống khí, tránh nhiệt độ quá cao vào buổi trƣa.
Mơi trƣờng dinh dƣỡng: Nồng độ và cách sử dựng nhƣ trong nuơi sinh khối bé. Sục khí liên tục 24/24.
Hình 2.3. Nuơi sinh khối trong túi nilong
Khi đạt đƣợc mật độ thích hợp (150.000tb/ml, túi tảo cĩ màu đậm) thì rút bớt cho ăn và tiếp tục cấy truyền.
2.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Số liệu đƣợc thống kê, trình bày dƣới dạng GTTB± độ lệch chuẩn và đƣợc phân tích trên phần mềm Excel. Các đồ thị, biểu đồ và bảng sẽ đƣợc vẽ trên Word hoặc Excel.
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Chuẩn bị hầu bố mẹ cho thí nghiệm
3.1.1. Lựa chọn hầu bố mẹ
Nguồn hầu Thái Bình Dƣơng bố mẹ đƣợc tuyển chọn từ các bè nuơi hầu thƣơng phẩm tại Cát Bà cĩ độ tuổi 1 năm trở lên. Các cá thể bố mẹ đƣợc tuyển chọn khoẻ mạnh, vân sinh trƣởng rõ ràng, vỏ khơng bị dập vỡ tổn thƣơng trong quá trình khai thác. Đồng thời phải cĩ tuyến sinh dục phát triển đầy đặn, bao phủ gần hết phần nội tạng, tuyến sinh dục đang ở giai đoạn chín muồi sinh dục đƣợc lựa chọn để tiến hành sinh sản. Lựa chọn các cá thể > 9 tháng tuổi, kích thƣớc >60 mm, khối lƣợng >70g (cỡ 13 – 15 con/kg).
3.1.2. Nuơi vỗ hầu bố mẹ
Nuơi vỗ tích cực là biện pháp kỹ thuật cần thiết để đàn hầu bố mẹ đƣa vào sinh sản cĩ điều kiện phát triển tuyến sinh dục và thành thục đồng đều. Quá trình nuơi vỗ cũng giúp hầu bố mẹ tích luỹ dinh dƣỡng và sức khoẻ tốt nhất trƣớc khi tham gia sinh sản nhƣ vậy sẽ cho chất lƣợng trứng, tinh trùng cũng nhƣ ấu trùng tốt nhất.
Thời gian nuơi vỗ trƣớc khi đƣa hầu vào sinh sản phải đƣợc trong vịng 2 tuần. Hầu bố mẹ đƣợc đƣa vào nuơi vỗ trong các bể cĩ thể tích 1 - 3 m3
với mật độ là 20-25 kg/m3, điều kiện mơi trƣờng ổn định và phù hợp (nhiệt độ, độ mặn, pH).
Thức ăn của hầu bố mẹ: Thức ăn thƣờng dùng cho nuơi vỗ hầu bố mẹ là các lồi tảo: N. oculata, I. galbana, C. calcitrans, C. muelleri, P. lutheri. Thơng thƣờng trong khẩu phần tảo trên thì Chaetoceros chiếm tới 30 - 40% trong khẩu phần ăn. Chế độ cho ăn là hỗn hợp các lồi tảo trên với mật độ tổng cộng là 18 – 20 vạn tb/ml, cho ăn 2 lần/ngày. Sau thời gian nuơi vỗ khoảng 15 ngày, tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu thành thục. Khi các cá thể đã thành thục thì tiến hành cho sinh sản.
3.2. Kết quả kiểm tra tỷ đực cái của hầu bố mẹ theo các nhĩm kích thƣớc
Thí nghiệm nghiên cứu trên các nhĩm kích thƣớc khác nhau từ kích thƣớc 60 – 70 mm đến nhĩm trên 100 mm. Mỗi nhĩm kích thƣớc lấy 30 cá thể hầu bố mẹ ngẫu nhiên từ đàn hầu bố mẹ đã nuơi vỗ để tiến hành kiểm tra chỉ tiêu tỷ lệ đực cái theo các nhĩm kích cỡ, kết quả đƣợc thể hiện dƣới Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Tỷ lệ đực/cái của hầu C.gigas theo các nhĩm kích cỡ Nhĩm (mm) Tổng số cá thể Đực Tỷ lệ (%) Cái Tỷ lệ
(%) Khơng phân biệt Tỷ lệ
(%) 60 - 70 30 19 63,33 7 23,33 4 13,33 71-80 30 21 70,00 9 30,00 0 0,00 81-90 30 17 56,66 13 43,33 0 0,00 91-100 30 16 53,33 14 46,66 0 0,00 >100 30 14 46,66 16 53,33 0 0,00
Kết quả nghiên cứu trên cho thấy, ở nhĩm kích cỡ 60 – 70 mm tỷ lệ cá thể đực chiếm cao hơn gấp đơi (63,33%) so với cá thể cái (23,33%), và cĩ một số cá thể chƣa phân biệt đƣợc tuyến sinh dục do chƣa thành thục sinh sản. Tƣơng tự nhƣ vậy, ở các nhĩm 71 – 80mm, 81 – 90 mm và 91 – 100mm, cá thể đực chiếm tỷ lệ cao hơn nhƣng cĩ xu thế cân bằng dần, số lƣợng cá thể cái tăng dần theo các nhĩm kích cỡ lớn dần. Kết quả này cũng khẳng định thêm vấn đề hầu TBD là lồi lƣỡng tính, ở giai đoạn đầu khi thành thục sinh sản cá thể đực thƣờng chín trƣớc và chiếm ƣu thế trong đàn. Tỷ lệ cá thể cái sẽ tăng dần theo khối lƣợng cơ thể và điều kiện mơi trƣờng nhiều thức ăn.
Hình 3.1: Tuyến sinh dục của hầu Thái Bình Dƣơng 3.3. Kết quả nghiên cứu tỷ lệ thành thục theo các nhĩm kích cỡ
Để kiểm tra tỷ lệ thành thục theo các nhĩm kích cỡ, thí nghiệm lấy hầu bố mẹ ở mỗi nhĩm kích cỡ khác nhau từ 60 mm đến trên 100 mm. Tiến hành giải phẫu lấy tuyến sinh dục soi trên kính hiển vi để quan sát và xác định các cá thể cĩ tuyến sinh dục giai đoạn III. Tuyến sinh dục cái nào căng đầy màu trắng sữa cĩ nang trứng hình bầu dục nhân to đạt kích thƣớc tối đa, các tuyến sinh dục đực nào màu trắng trong nang tinh kích thƣớc lớn tinh hoạt động mạnh thì đƣợc đƣa vào thành thục nhĩm III
(Sẵn sàng tham gia sinh sản). Thời điểm kiểm tra từ tháng 5 đến tháng 8, đây là những tháng trong mùa vụ sinh sản của hầu TBD ngồi tự nhiên ở khu vực phía Bắc. Mỗi tháng thí nghiệm tiến hành một lần, kết quả đƣợc thể hiện qua Bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kích thƣớc và tỷ lệ thành thục STT Nhĩm cỡ (mm) Tổng số mẫu Cá thể thành thục GĐ III Tỷ lệ % 1 60- 70 30 8 26,66 2 71-80 30 14 46,66 3 81-90 30 19 63,33 4 91-100 30 21 70,00 5 >100 30 24 80,00
Từ kết quả nghiên cứu trên cĩ thể thấy mối quan hệ giữa sự thành thục sinh sản của hầu TBD với kích thƣớc cơ thể. Ở nhĩm cĩ kích thƣớc 60 – 70 mm tỷ lệ thành thục tƣơng đối thấp (26,7%) và chủ yếu là cá thể thành thục lần đầu. Nhĩm kích thƣớc 71 – 80 mm tỷ lệ thành thục cao hơn (46,7%), cá thể cĩ tuyến sinh dục thành thục chiếm gần một nửa số lƣợng cá thể mẫu. Lần lƣợt các nhĩm kích thƣớc 81 – 90 mm, 91 – 100 mm, trên 100 mm cĩ tỷ lệ thành thục là 63,3%, 70,0%, 80,0% cho thấy sự gia tăng tỷ lệ thành thục tỷ lệ thuận với sự gia tăng về kích thƣớc cơ thể. Hầu TBD bắt đầu thành thành thục sinh sản ở khoảng 1 năm tuổi. Tuy nhiên, sự thành thục sinh sản cịn phụ thuộc rất lớn bởi kích thƣớc cơ thể cũng nhƣ mức độ sẵn cĩ của thức ăn trong mơi trƣờng. Trong điều kiện thức ăn đầy đủ, hầu tăng trƣởng nhanh về kích thƣớc cơ thể và tỷ lệ thành thục cao.
3.4. Tỷ lệ thành thục của hầu TBD theo các tháng trong mùa vụ sinh sản
Mùa vụ sinh sản của hầu TBD ở khu vực vịnh Bắc Bộ là khoảng tháng 5 – 8 hàng năm (theo kết quả nghiên cứu của Đề tài KC.06.18/06-10). Tuy nhiên, trong từng tháng tỷ lệ thành thục khác nhau. Để nghiên cứu tỷ lệ thành thục cửa hầu TBD và đƣa ra kết luận tháng cĩ tỷ lệ hầu TBD thành thục sinh sản cao nhất, Đề tài tiến hành mỗi tháng (từ tháng 5 đến tháng 8) mỗi tháng lấy mẫu 1 lần vào thời điểm giữa tháng, phẫu thuật lấy tuyến sinh dục kiểm tra và lấy kết quả những cá thể đạt giai đoạn III. Kết quả đƣợc thể hiện qua bảng qua bảng 3.3:
Bảng 3.3. Tỷ lệ thành thục theo các tháng trong mùa vụ sinh sản TT Tháng Tổng số mẫu Con thành thục giai đoạn III Tỷ lệ %
1 15/5 30 24 80,00
2 15/6 30 19 63,33
3 16/7 30 22 73,33
4 15/8 30 17 56,67
Theo kết quả từ Bảng 3.3 cho thấy trong mùa vụ sinh sản của hầu (trong khu vực vịnh Bắc Bộ) trong khoảng từ tháng 5 – 8 thì thời điểm cĩ tỷ lệ thành thục cao nhất vào khoảng tháng 5 (80,00%) tháng 7 (73,33%), các tháng 6 và tháng 8 cĩ tỷ lệ thành thục thấp hơn là 63,33% và 56,67%. Ở tháng 6 và tháng 8 khi tiến hành thí nghiệm, kết quả cho thấy gặp nhiều cá thể cĩ tuyến sinh dục giai đoạn IV (đã sinh sản) và cá thể đang trong thời gian tái phát dục. Đồng thời, theo kết quả nghiên cứu về các chỉ số mơi trƣờng của đề tài KC.06.18/06-10 cho thấy vào thời điểm này nhiệt độ nƣớc biển dao động: 18,8-30,5oC. Độ muối: 30,5-32‰; pH: 8,1-8,3; Oxy: 6,25-6,7mg/l. Các hợp chất hữu cơ BOD5: 2,01- 3,24mg/l, 2,12-3,47mg/l. Hàm lƣợng BOD5 và COD khơng vƣợt quá giới hạn cho phép. Thực vật phù du trong nƣớc biển phong phú, trong đĩ ngành tảo Silic đạt 128 lồi (chiếm 87,67%). Nhƣ vậy, các yếu tố trên là cơ sở cho thấy điều kiện mơi trƣờng và nguồn thức ăn tự nhiên vào các tháng này thích hợp cho tuyến sinh dục của hầu thành thục.
3.5. Kết quả nghiên cứu sự ảnh hƣởng của các biện pháp kích thích sinh sản đến các chỉ tiêu sinh sản và chất lƣợng giống hầu TBD các chỉ tiêu sinh sản và chất lƣợng giống hầu TBD
3.5.1. Ảnh hưởng của các biện pháp kích thích sinh sản lên tỷ lệ đẻ
Để nghiên cứu ảnh hƣởng của các biện pháp kích thích sinh sản lên sức sinh sản của hầu TBD, thí nghiệm tiến hành trên mỗi phƣơng pháp kích thích sinh sản 15 cá thể hầu TBD bố mẹ. Trong quá trình thực hiện kích thích sinh sản, quan sát thấy cá thể nào cĩ hiện tƣợng chuẩn bị giải phĩng trứng hoặc tinh trùng (hầu vận động mở nắp vỏ) thì vớt ra thùng nhựa cĩ mơi trƣờng nƣớc nhƣ bể kích thích sinh sản để các cá thể trên tiếp tục phĩng tinh – đẻ trứng. Sau khi các cá thể đã phĩng tinh và đẻ trứng xong thì đƣợc vớt ra và tiến hành định lƣợng tổng số trứng do các cá thể cái đã giải phĩng ra
mơi trƣờng nƣớc. Tổng số trứng thu đƣợc chia cho tổng số cá thể cái tham gia sinh sản lấy trung bình để tính sức sinh sản hữu hiệu.
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của các biện pháp kích thích sinh sản lên tỷ lệ đẻ và sức sinh sản hữu hiệu của hầu TBD
Lơ thí nghiệm
Sức sinh sản hữu hiệu
(Trung bình/cá thể cái) Tỷ lệ đẻ (%) A 14.566.667 ± 1.365.040 17,77 ± 3,85a B 17.266.666 ± 1.662.327 28,89 ± 3,85b C 15.933.333 ± 1.242.309 26,67 ± 6,67ab AB 19.242.857 ± 1.084.868 40,00 ± 6,67c AC 14.133.333 ± 305.505 26,67 ± 6,67ab BC 16.666.666 ± 862.168 37,78 ± 3,85c ABC 16.533.333 ± 680.686 40,00 ± 0,00c
Kết quả thí nghiệm ứng dụng các biện pháp kích thích sinh sản lên hầu TBD ở Bảng 3.4 cho thấy: Tỷ lệ đẻ cao nhất là phƣơng pháp AB và phƣơng pháp ABC (40 ± 6,7% và 40 ± 0%) và sai khác cĩ ý nghĩa thống kê với các phƣơng pháp cịn lại, tỷ lệ đẻ thấp nhất khi sử dụng phƣơng pháp A chỉ đạt 17,8 ± 3,9%) (P < 0,05).
Kết quả thí nghiệm cũng cho thấy: Biện pháp kích thích sinh sản AB (phƣơng pháp kích thích bằng phơi khơ và nâng nhiệt) cho sức sinh sản hữu hiệu/cá thể cao nhất (TB 19.242.857 trứng/cá thể hầu cái), thấp nhất là phƣơng pháp AC (phƣơng pháp kích thích kết hợp phơi khơ và hố chất NH4OH – TB 14.133.333 trứng/ cá thể hầu cái).
3.5.2. Ảnh hưởng của các biện pháp kích thích sinh sản lên tỷ lệ thụ tinh của hầu
Sau khi trứng và tinh trùng đƣợc hầu bố mẹ đẻ khoảng 2 – 3 giờ, trong quá trình đĩ đã xảy ra quá trình thụ tinh. Quan sát qua kính hiển vi thấy trứng thụ tinh chuyển từ hình ơ van sang hình trịn (trứng co trịn lại), xuất hiện màng thụ tinh, nhân tan dần trong nguyên sinh chất. Sau 45 - 55 phút xuất hiện cực cầu cấp 1, cực cầu cấp 2, sau 70 phút phân chia thành 2 tế bào, quá trình phân cắt nhiều lần liên tiếp theo thành phơi nang ( 8 giờ ), phơi vị (9 giờ ). Ở thời kỳ phơi vị, phơi cĩ dạng hình cầu, trên bề mặt cĩ phủ tiêm mao, nên phơi cĩ thể vận động quay trịn, theo chiều ngƣợc kim đồng hồ và theo chiều kim đồng. Phơi cĩ thể quay một mình, hoặc tập trung thành từng nhĩm từ 2
- 15 phơi xoay quanh nhau, quay rất nhanh. Trong thời gian này,thí nghiệm tiến hành lấy mẫu để xác định ảnh hƣởng của các biện pháp kích thích sinh sản lên tỷ lệ thụ tinh