Mỗi tháng trong thời điểm thành thục của hầu từ tháng 5 – 7 chọn 30 mẫu theo các nhĩm kích cỡ: 60- 70mm; 71 – 80mm; 81 – 90mm; 91 – 100mm để kiểm tra các chỉ tiêu :
+ Tỷ lệ đực cái theo các nhĩm kích thƣớc 60 – 100 mm.
+ Nghiên cứu kích cỡ thành thục của hầu bố mẹ: Tỷ lệ thành thục của các nhĩm cá thể hầu bố mẹ với các nhĩm cĩ kích cỡ từ 60 – 100mm.
+ Nghiên cứu tỷ lệ thành thục của hầu bố mẹ theo các tháng trong mùa vụ sinh sản (từ tháng 5 đến tháng 8).
* Phƣơng pháp tiến hành thí nghiệm
Xác định tỷ lệ thành thục của hầu bố mẹ theo các tháng trong mùa vụ sinh sản: Phẫu thuật hầu bố mẹ lấy tuyến sinh dục, hồ tan với nƣớc biển sạch. Lấy mẫu soi trên kính hiển vi xác định giai đoạn thành thục. Mỗi lần phẫu thuật 30 cá thể hầu bố mẹ, cơng thức tính:
Tỷ lệ thành thục (%) = Tổng số cá thể giai đoạn II x 100% Tổng số cá thể mẫu
Tỷ lệ thành thục theo kích thƣớc: Lấy mẫu hầu bố mẹ theo các nhĩm kích thƣớc từ 60mm đến 100mm phẫu thuật kiểm tra tuyến sinh dục trên kính hiển vi, xác định các cá thể cĩ tuyến sinh dục thành thục. Mỗi lần lấy 30 mẫu, tỷ lệ thành thục theo các nhĩm kích thƣớc, cơng thức tính giống cơng thức tính tỷ lệ thành thục:
Tỷ lệ thành thục theo nhĩm kích thƣớc (%) =
Tổng số cá thể giai đoạn III
x 100% Tổng số cá thể mẫu
2.2.3.2. Nghiên cứu sự ảnh hưởng của các biện pháp kích thích sinh sản đến các chỉ tiêu:
+ Tỷ lệ thụ tinh + Tỷ lệ nở của trứng
+ Tỷ lệ sống của ấu trùng các giai đoạn và đến con giống
* Phƣơng pháp tiến hành thí nghiệm
Kích thích hầu bố mẹ phĩng tinh đẻ trứng: Các phƣơng pháp kích thích hầu bố
mẹ phĩng tinh - đẻ trứng (phƣơng pháp A, B, C, AB, AC, BC, ABC) đều đƣợc thực hiện trên 15 – 30 cá thể bố mẹ cho mỗi phƣơng pháp, mỗi phƣơng pháp lặp lại 3 lần. Bể đẻ đƣợc sử dụng là bể composite 0,5m3
.
+ Phƣơng pháp A: Phơi khơ, hầu bố mẹ đƣợc xếp vào khay hƣớng miệng lên trên đƣa ra ngồi trời 30 phút sau đĩ đƣa vào bể đẻ.
+ Phƣơng pháp B: Kích thích bằng nhiệt độ, hầu bố mẹ đƣợc xếp vào khay hƣớng miệng lên trên đƣa vào bể đẻ. Từ nhiệt độ nƣớc trong bể đẻ, nâng nhiệt độ lên cao hơn ban đầu 4 -5oC khoảng 30 phút, sau đĩ chuyển sang bể khác cĩ nhiệt độ nhƣ ban đầu 30 phút lại chuyển vào bể đã nâng nhiệt. Quá trình sốc nhiệt sẽ kích thích hầu bố mẹ phĩng tinh đẻ trứng. Thơng thƣờng, nhiệt độ phù hợp của nƣớc biển là 26-28o
C và độ mặn là 30ppt. Nâng nhiệt độ nƣớc trong bể sinh sản lên 4 – 5oC trong thời gian 30 phút; duy trì nhiệt độ này trong khoảng thời gian 15 phút. Sau đĩ, các cá thể bố mẹ đƣợc chuyển sang bể sinh sản cĩ nƣớc biển ở nhiệt độ bình thƣờng (28oC) để gây sốc nhiệt. Quá trình gây sốc nhiệt cĩ thể lặp lại 2 – 3 lần liên tục tùy theo phản ứng của hầu bố mẹ. Thơng thƣờng, cá thể bố mẹ cĩ tình trạng phát triển sinh dục tốt sẽ đẻ sau 1 – 2 lần gây sốc nhiệt. Nếu quá trình sốc nhiệt lặp lại nhiều lần (4 lần trở lên) hầu bố mẹ khơng cĩ phản ứng thì nên dừng lại và cĩ thể xác định số cá thể bố mẹ này cĩ chất lƣợng khơng tốt;
+ Phƣơng pháp C (Dùng NH4OH): Hầu bố mẹ đƣợc xếp vào khay hƣớng miệng lên trên đƣa vào bể đẻ. Pha hydroxyt amon vào nƣớc biển với nồng độ thấp 0,1M (cứ mỗi 5 lít cho thêm 3 – 4 giọt). Sau thời gian 30 phút đến 1h, hầu bắt đầu đẻ trứng.
+ Phƣơng pháp AB: Kết hợp phƣơng pháp A và B, phơi khơ hầu bố mẹ 30 phút sau đĩ đƣa vào bể đẻ, nâng nhiệt độ lên so với nhiệt độ nƣớc ban đầu 4-5o
C.
+ Phƣơng pháp AC: Kết hợp phƣơng pháp A và C, phơi khơ hầu bố mẹ 30 phút sau đĩ đƣa vào bể đẻ, pha hydroxyt amon vào nƣớc biển với nồng độ thấp 0,1M (cứ mỗi 5 lít cho thêm 3 – 4 giọt).
+ Phƣơng pháp BC: Kết hợp phƣơng pháp B và C, đƣa hầu bố mẹ vào bể đẻ, nâng nhiệt độ lên so với nhiệt độ nƣớc ban đầu 4-5oC, pha hydroxyt amon vào nƣớc biển với nồng độ thấp 0,1M (cứ mỗi 5 lít cho thêm 3 – 4 giọt)
+ Phƣơng pháp ABC: Kết hợp phƣơng pháp A, B và C, phơi khơ hầu bố mẹ 30 phút sau đĩ đƣa vào bể đẻ, nâng nhiệt độ lên so với nhiệt độ nƣớc ban đầu 4-5o
C tiếp theo pha hydroxyt amon vào nƣớc biển với nồng độ thấp 0,1M (cứ mỗi 5 lít cho thêm 3 – 4 giọt).
Theo dõi phản ứng của các cá thể bố mẹ trong quá trình kích thích, tách các cá thể cĩ hiện tƣợng giải phĩng sản phẩm sinh dục ra từng khay cĩ chứa nƣớc biển riêng biệt để cho chúng tiếp tục đẻ tiếp trong đĩ. Việc tách riêng từng cá thể bố mẹ riêng biệt trong sinh sản giúp cho việc xác định số lƣợng và chất lƣợng sản phẩm sinh dục dễ dàng và việc thụ tinh cĩ thể đạt tỷ lệ cao. Trong quá trình sinh sản, cần phải kiểm tra số lƣợng và chất lƣợng trứng và tinh trùng của các cá thể bố mẹ để xác định và lựa chọn sản phẩm sinh dục tốt cho thụ tinh. Tỷ lệ thụ tinh tối thiểu là 1 - 2 tinh trùng /1 trứng. Thơng thƣờng tỷ lệ 3-7 tinh trùng/trứng là tốt nhất.
Thu trứng: Sau khi đẻ chừng 30 phút, vớt bỏ hầu bố mẹ ra ngồi và tiến hành lọc trứng. Dùng các loại vợt hoặc túi lọc cĩ kích thƣớc mắt lƣới 40µm để lọc thu trứng. Trƣớc khi lọc trứng nên chuẩn bị trƣớc bể ấp trứng, nƣớc biển lọc cát, lọc tinh qua ống lọc 5µm cung cấp cho bể ƣơng. Sau khi lọc xong, chuyển trứng đã thụ tinh qua bể ƣơng, ƣơng với mật độ 15-20 trứng/ml, sục khí nhẹ.
Ngay sau khi đƣợc giải phĩng khỏi tuyến sinh dục, trứng thƣờng cĩ hình quả lê. Trứng sẽ trịn dần ngay khi đƣợc đƣa vào mơi trƣờng nƣớc. Trứng sau khi thụ tinh cĩ dạng hình cầu trịn đều, tế bào chất trở lên đặc lại và nhân dần biến mất. Dấu hiệu đầu tiên của sự phát triển phơi là thể cực. Thời gian xuất hiện thể cực thứ nhất khoảng 20 phút và thể cực thứ 2 là 40 phút từ khi thụ tinh hồn thành. Thời gian này cĩ thể dao động và phụ thuộc vào nhiệt độ, độ mặn và chất lƣợng trứng thụ tinh. Trứng phát triển sang giai đoạn bơi tự do (trochophore) sau khoảng 6 tiếng và chuyển sang giai đoạn ấu trùng chữ D sau khoảng 16 tiếng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Xác định tỷ lệ thụ tinh:Sau khi chuyển trứng và tinh trùng vào các lơ thí nghiệm thì cứ sau 20 phút, tiến hành thu mẫu ở các lơ thí nghiệm đƣa lên kính hiển vi qua sát sự thụ tinh, quá trình phân cắt của phơi. Xác định tỷ lệ thụ tinh theo cơng thức:
Tỷ lệ thụ tinh (%) = Số trứng thụ tinh x 100 Số trứng trong mẫu lấy trong bể
- Tính tỷ lệ nở của trứng:
Tỷ lệ nở (%) = Tổng số ấu trùng bánh xe x 100 Tổng số trứng thụ tinh
Ương nuơi ấu trùng:
Mật độ ấu trùng: Mật độ ấu trùng hầu thay đổi trong quá trình ƣơng. Giai đoạn 5 ngày đầu mật độ cĩ thể từ 15-20 cá thể/ml (15-20 triệu/m3). Giai đoan trên 15 ngày mật độ là 7 triệu/m3, giai đoạn cuối chỉ nên ƣơng với mật độ 5 con/ml (5 triệu con/m3
).
Sự phát triển của ấu trùng hầu Thái Bình Dương:
+ Ấu trùng Veliger: Xuất hiện ấu trùng Veliger sau 16-24 giờ từ khi thụ tinh, ấu trùng cĩ dạng chữ D, cĩ 2 nắp vỏ và cĩ vành tiêm mao giữa 2 nắp vỏ, ấu trùng vận động nhanh nhờ sự vận động của vành tiêm mao miệng. Giai đoạn này kéo dài từ 2 - 6 ngày và kích thƣớc ấu trùng dao động từ 75 - 120µm.
+ Ấu trùng Umbo: Đặc trƣng của giai đoạn này là sự hình thành các cơ quan bao gồm: giai đoạn Umbo sơ kỳ, bắt đầu xuất hiện mầm cơ khép vỏ. Quan sát trên kính hiển vi thấy ruột và một đơi cơ quan trong suốt. Giai đoạn Umbo trung kỳ xuất hiện đỉnh vỏ, kích thƣớc ấu trùng đạt 130 - 200µm. Giai đoạn hậu kỳ đỉnh vỏ, ấu trùng xuất hiện điểm mắt, kích thƣớc ấu trùng tăng nhanh, cuối giai đoạn Umbo hậu kỳ xuất hiện điểm mắt ở gần phía đỉnh vỏ, một số cá thể hình thành chân bị
+ Ấu trùng bám: Sau khi xuất hiện chân bị, hoạt động bơi của ấu trùng giảm dần, ấu trùng chuyển xuống bị dƣới đáy, lúc này vành tiêm mao và điểm mắt thối hố dần. Đặc trƣng của giai đoạn này là sự hình thành tơ chân, màng áo và một số cơ quan khác. ấu trùng chuyển sang giai đoạn sống bám. Kích thƣớc ấu trùng ở giai đoạn này khoảng 270 - 330µm. Trong sản xuất giống nhân tạo, đây là thời điểm đặc biệt quan trọng trong việc thả vật bám để thu con giống bám ngay trong bể ƣơng.
Quản lý và chăm sĩc bể ương ấu trùng :
+ Nƣớc dùng cho bể ƣơng: phải qua xử lý lắng, lọc cát, lọc tinh qua ống lọc 5 - 10µm. Mơi trƣờng nƣớc phải đƣợc duy trì ổn định trong suốt quá trình ƣơng, chênh
lệch nhiệt độ khơng quá 2oC, chênh lệch độ mặn khơng quá 5‰. Sục khí liên tục 24/24h đảm bảo lƣợng oxy hồ tan trên 5mg/l.
+ Chế độ cấp khí: Cấp khí thƣờng xuyên 24/24 giờ, tuỳ theo hình dạng bể ƣơng mà dùng 1 hoặc nhiều vịi khí. Bể trịn 2-3 m3
thì chỉ cần 1 vịi khí là đủ, bể vuơng 4m3 nên dùng 3-5 vịi khí, đảm bảo nƣớc xáo trộn đều, ấu trùng khơng bị chìm xuống đáy, lƣợng oxy cung cấp trong bể thƣờng xuyên 4 – 6mg/l.
+ Chế độ thay nƣớc: Thay 1/3 đến 1/2 thể tích nƣớc trong bể ƣơng hàng ngày, sau 2 ngày thay 100% nƣớc trong bể ƣơng và chuyển bể mới. Nƣớc mới thay phải cĩ những điều kiện thích hợp tƣơng tự nhƣ cùng nhiệt độ, độ mặn... với mơi trƣờng nƣớc đang ƣơng.
Thức ăn và phương pháp cho ăn:
Thức ăn cho ấu trùng hầu ở giai đoạn đầu chủ yếu là tảo Nannochloropsis oculata kéo dài 2 ngày. Sau đĩ cung cấp thêm tảo Chaetoceros muelleri, Chaetoceros calcitrans, Isochrysis galbana các lồi tảo khác ở giai đoạn trên 8 ngày nhƣ
Tetraselmis chuii, Nannochloropsis galbana chỉ bổ sung với tỷ lệ 10-15%/lồi. Ấu trùng đƣợc cho ăn 2 lần/ngày với mật độ tảo là 40.000-50.000 tế bào/ấu trùng/ngày và tăng dần lên đến mật độ 100.000-160.000 tế bào/ấu trùng/ngày khi đạt đến cỡ 0,5cm. Mật độ này cĩ thể thay đổi tùy theo khả năng tiêu thụ của ấu trùng.
Bảng 2.1: Chế độ cho ăn trong ƣơng ấu trùng hầu TBD Giai đoạn Tuổi Kích thƣớc (µm) Mật độ nuơi AT/ml Thức ăn (Tb/ml) Loại và lƣợng thức ăn (lần/ngày) Trứng 0 - 24h 50 20 trứng/ml ấu trùng chữ D 24 giờ 70 - 90 10 40000 100% (N) 1 Umbo trung kỳ 4 - 5 ngày 100 - 120 5 – 10 60000 1/3 N+1/3 I+1/3 C 2 Umbo hậu kỳ 8 – 12 Ngày 150 - 200 5 – 10 80000 1/3 N + 1/3 I + 1/3 C 2 AT điểm mắt 14-21 Ngày 230 - 350 5 140000 1/3 N + 1/3 I + 1/3 C 2 Spat sớm 21 ngày > 400 5 160000 1/3 N + 1/3 I + 1/3 C 2
Ghi chú: N: N. oculata; I: I. galbana (hoặc Tetraselmis chuii); C: C. Calcitrans (hoặc C. muelleri).
Định lƣợng ấu trùng trong bể ƣơng: Lấy mẫu ở 4 gĩc bể, cách thành bể 20 cm và ở giữa bể 1 ml nƣớc trong bể cho vào buồng đếm, đếm số ấu trùng. Lấy ở ba tầng nƣớc (tầng mặt, giữa, đáy)
T = A x D
Trong đĩ: T: Tổng số ấu trùng trong bể A: Số ấu trùng đếm đƣợc/ mẫu D: Thể tích bể (m3
)
2.3. Điều kiện cho thí nghiệm.
2.3.1. Các thiết bị, dụng cụ dùng cho thí nghiệm
Bảng 2.2. Cở sở vật chất, trang thiết bị cho thí nghiệm STT Nội dung Đơn vị tính Số lƣợng
1 Bể đẻ (0,5 m3 ) Cái 4 2 Bể ƣơng (5 m3 ) Cái 10 3 Bể lọc thơ (5 m3 ) Cái 2 4 Bể lọc tinh Cái 1 5 Bể chứa (25 m3 ) Cái 2 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
6 Máy bơm 10 kw/h Cái 1
7 Máy bơm 0,75 kw Cái 1
8 Máy nén khí 2 kw/h Cái 1
9 Máy nén khí 0,5 kw/h Cái 1
10 Kính hiển vi Cái 1
11 Giấy thấm mẫu, lau kính hiển vi hộp 10
12 Lam kính + lamen hộp 5
13 Buồng đếm Thomas cái 2
14 Foomol thí nghiệm lít 1
15 Vợt lọc trứng và ấu trùng hầu Cái 10 16 Heater (Cơng suất 2.000 W) Cái 2
17 NH4OH (Đã pha sẵn) Lít 1
2.3.2. Chuẩn bị nguồn nước biển cho thí nghiệm.
Dùng máy bơm nối với đƣờng ống dẫn nƣớc đƣa xa bờ 200m, khi thuỷ triều lên cao nhất, tiến hành bơm vào 2 bể chứa 25 m3. Để 10 giờ cho lắng hết vẩn đục tiến hành lọc thơ qua 2 bể lọc cát tiếp tục tinh qua 1 bể lọc tinh sau đĩ đƣa vào bể đẻ, bể ƣơng ấu trùng và nuơi tảo.
2.3.3. Phương pháp lưu giữ giống tảo
2.3.3.1. Phương pháp lưu giữ trong bình thuỷ tinh
Sau khi thu nhận đƣợc tảo thuần từ các giống tảo thì việc lƣu giữ giống là điều quan trọng nhằm duy trì giống, cung cấp cho việc nuơi sinh khối sau này.
* Yêu cầu kỹ thuật:
Giống đƣợc lƣu trong các chai lọ bằng thuỷ tinh cĩ dung tích từ 50 – 500ml. Bảo quản trong tủ làm mát và duy trì nhiệt độ ổn định khoảng 18 – 20o
C.
Giống đƣợc lấy để lƣu giữ khi tảo đang ở giai đoạn phát triển nhanh, cĩ sức sống khoẻ.
Mật độ tảo lƣu giữ thấp khoảng 1 – 1,5 x 106
tb/ml.
Hàng tuần, bổ sung khoảng 10% chất dinh dƣỡng vào mơi trƣờng bảo quản. Liên tục đƣợc cấy truyền khi mật độ tảo trong các bình lƣu giữ dầy lên.
2.3.3.2. Lưu giữ giống bằng cách cấy trên mơi trường thạch agar:
Tạo mơi trƣờng: Hồ tan 4,5g agar trong 500 ml nƣớc biển đun sơi 2 lần, cho 5ml mơi trƣờng vào, bổ sung thêm vitamin B1 và B12. Sau đĩ, đổ đều mơi trƣờng agar vào đĩa lồng hoặc ống nghiệm và bảo quản trong tủ mát, các đĩa tảo đã phát triển tốt bảo quản trong tủ lƣu giống.
* Một số lưu ý trong quá trình thực hiện lưu giữ giống tảo
Khử trùng
Đây là điều quan trọng trong lƣu giữ giống các lồi vi tảo. Mọi dụng cụ sử dụng, mơi trƣờng nuơi cấy tảo phải đƣợc khử trùng bằng cách đặt ở điều kiện nhiệt độ 120o
C trong vịng 15 – 30 phút.
Ánh sáng và nhiệt độ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tảo đƣợc lƣu giữ trong tủ làm lạnh cĩ gắn nhiệt kế. Để duy trì và lƣu gữ giống tảo, ngƣời ta chọn phƣơng pháp dùng ánh sáng yếu và nhiệt độ đƣợc điều chỉnh trong khoảng từ 15 – 20o
C.
2.3.3.3. Cấy truyền
Tần suất của cấy truyền phụ thuộc vào điều kiện giữ giống và tuỳ thuộc vào lồi tảo. Thƣờng thì khi mật độ trong các bình lƣu giống cao (cĩ thể quan sát bằng mắt thƣờng) thì cĩ thể tiến hành cấy truyền.
San tảo sang một bình thuỷ tinh mới, bổ sung nƣớc và mơi trƣờng, vitamin tiếp tục lƣu giống bình thƣờng trong tủ làm mát.
Lưu ý: Nƣớc dùng để cấy truyền phải đƣợc khử trùng tốt, trƣớc khi cấy truyền cho vào tủ giữ giống cho nhiệt độ nƣớc và nhiệt độ bình lƣu giống cân bằng nhau. Sự chênh lệch nhiệt độ cĩ thể làm chết các lồi tảo giống.
2.3.3.4. Nguồn nước
Nƣớc cung cấp cho lƣu giữ giống vi tảo là nƣớc biển chứa trong bể cĩ nắp đậy, để lắng và đƣợc lọc qua ống lọc cĩ cỡ mắt lƣới lọc 1, nƣớc đƣợc đun sơi và để nguội.
2.3.3.5. Mơi trường dinh dưỡng
Hiện nay cĩ rất nhiều loại mơi trƣờng dinh dƣỡng dùng cho tảo, dƣới đây là một số mơi trƣờng dinh dƣỡng hay dùng cho tảo