nẩy mầm và phát triển mầm của hạt ngô
2.6.2.1. Phương pháp thí nghiệm
Chọn 6 mẫu hạt ngô, mỗi mẫu 50 hạt kích thước tương đối đồng đều (khối lượng 12,57±0,01 g). Ngâm hạt trong các dung dịch phức chất có nồng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
độ 30, 60, 120, 180, 240 ppm (mẫu so sánh ngâm trong nước cất). Thể tích các dung dịch phức chất và nước cất đem ngâm là 100 ml. Sau thời gian 24 giờ vớt ra và ủ hạt trong cốc cỡ 500 ml, được lót dưới và đậy trên bằng giấy lọc và đặt trong tủ ủ ấm ở nhiệt độ 300
C. Các dung dịch ngâm được thu hồi để tưới lại lần sau. Hàng ngày tưới hạt bằng các dung dịch phức và nước cất theo thứ tự các mẫu, ngày tưới 3 lần, mỗi lần 30 phút.
Sau khi mầm hạt phát triển được số ngày tuổi nhất định, chúng tôi tiến hành xác định tỷ lệ nảy mầm của hạt, đo độ dài thân và rễ của từng cây trong các mẫu thí nghiệm. Các thí nghiệm được lặp lại 5 lần [13].
2.6.2.2. Ảnh hưởng của phức chất đến sự nảy mầm của hạt ngô
Sau khi ủ hạt được một ngày, đếm số hạt nảy mầm từ đó tính tỷ lệ nảy mầm của hạt. Kết quả được trình bày ở bảng 2.7.
Bảng 2.7. Ảnh hƣởng của phức chất H3[Tm(His)3Cl3].3H2O đến sự nảy mầm của hạt ngô Mẫu 1 2 3 4 5 6 Nồng độ phức H3[Tm(His)3Cl3].3H2O ppm 0(H2O) 30 60 120 180 240 Tỷ lệ nảy mầm (%) 94,00 96,00 90,00 86,00 82,00 80,00 N 5
Nhận xét: Phức chất có tác dụng ức chế sự nảy mầm của hạt ngô. Sự ức chế làm giảm tỷ lệ nảy mầm của hạt ngô. Sự ức chế rõ rệt và tăng theo nồng độ.
2.6.2.3. Ảnh hưởng của phức chất đến sự phát triển mầm của hạt ngô
Khi mầm hạt phát triển được 4 ngày tuổi, chúng tôi tiến hành đo chiều cao của mầm và độ dài của rễ. Dùng thước đo có chia độ đến mm để đo. Đối với mầm đo từ cổ rễ đến mút lá.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 2.8. Ảnh hƣởng của nồng độ phức chất H3[Tm(His)3Cl3].3H2O đến sự phát triển mầm của ngô
Mẫu 1 2 3 4 5 6
Nồng độ phức
H3[Tm(His)3Cl3].3H2O (ppm) 0(H2O) 30 60 120 180 240
Thời gian (ngày) 4 ngày
d T (cm) 3,46 3,25 2,95 2,59 2,17 1,93 d R (cm) 2,82 2,53 2,29 1,98 1,73 1,52 AT (%) 100 93,94 85,26 74,85 62,72 55,78 AR (%) 100 89,71 81,20 70,21 61,35 53,90 n 5 n : độ lặp lại
d T: là độ dài trung bình của thân mầm ngô
d R : là độ dài trung bình của rễ mầm ngô AT là % độ dài thân so với đối chứng AR là % độ dài rễ so với đối chứng
AT, AR= X
SS
d
d .100 (%)
d SS: Độ dài trung bình thân, rễ của mầm ngô ở mẫu so sánh (đối chứng).
d X: Độ dài trung bình thân, rễ của mẫu xử lý.
Hình 2.16. Ảnh hƣởng của nồng độ phức chất H3[Tm(His)3Cl3].3H2O đến sự nảy mầm hạt ngô
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Mẫu 1 2 3 4 5 6 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nồng độ phức chất
(ppm) 0(H2O) 30 60 120 180 240
Nhận xét: Từ kết quả ở bảng 2.8, hình 2.16 cho thấy phức chất có tác dụng ức chế sự phát triển mầm của hạt ngô. Sự ức chế làm giảm chiều cao của mầm và độ dài của rễ. Trong khoảng nồng độ khảo sát từ 30 ÷ 240 ppm, phức chất có tác dụng ức chế sự phát triển mầm của hạt ngô. Sự ức chế tăng chậm khi nồng độ của phức chất tăng.
2.6.2.4. So sánh ảnh hưởng của phức chất, ion kim loại và phối tử đến sự nảy mầm của ngô
Để so sánh ảnh hưởng của phức H3[Tm(His)3Cl3].3H2O, ion kim loại và phối tử đến sự nảy mầm của hạt ngô, chúng tôi tiến hành thí nghiệm với các mẫu:
Mẫu 1: H2O
Mẫu 2: Dung dịch phức H3[Tm(His)3Cl3].3H2O nồng độ 120 ppm. Mẫu 3: Dung dịch muối Tm3+ nồng độ 120 ppm.
Mẫu 4: Dung dịch L- histidin nồng độ 360 ppm.
Thời gian ủ hạt là 1 ngày. Kết quả được trình bày ở bảng 2.9.
Bảng 2.9: Ảnh hƣởng của hàm lƣợng phức H3[Tm(His)3Cl3].3H2O, TmCl3, và L- histidin đến sự nảy mầm của hạt ngô
STT 1 2 3 4
Mẫu H2O H3[Tm(His)3Cl3].3H2O TmCl3 L- His
Nồng độ (ppm) 0 120 120 360
Tỷ lệ nảy mầm (%) 94,00 86,00 88,00 84,00
Cũng như phức chất, phối tử và ion trung tâm có tác dụng ức chế sự nảy mầm của hạt ngô. Phức chất có tác dụng ức chế kém hơn phối tử và tốt hơn ion trung tâm.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.6.2.5. So sánh ảnh hưởng của phức chất, ion kim loại và phối tử đến sự phát triển mầm của hạt ngô
Khi mầm hạt phát triển được 4 ngày tuổi, chúng tôi tiến hành đo chiều cao của mầm và độ dài của rễ.
Kết quả được trình bày ở bảng 2.10, hình 2.17.
Bảng 2.10: Kết quả so sánh ảnh hƣởng của phức H3[Tm(His)3Cl3].3H2O, TmCl3, và L- histidin đến sự phát triển mầm của hạt ngô
Mẫu 1 2 3 4
Dung dịch H2O H3[Tm(His)3Cl3].3H2O TmCl3 L- His
Nồng độ (ppm) 0 120 120 360
Thời gian (ngày) 4
d T (cm) 3,46 2,59 2,68 2,31 d R (cm) 2,82 1,98 2,01 1,73 AT (%) 100 74,85 77,45 66,76 AR (%) 100 70,21 71,27 61,35 N 5 Hình 2.17. Ảnh hƣởng của phức H3[Tm(His)3Cl3].3H2O, TmCl3, và L- histidin đến sự phát triển mầm của hạt ngô
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Từ kết quả ở bảng 2.10, hình 2.17 cho thấy cũng như phức chất, phối tử và ion kim loại có tác dụng ức chế sự phát triển mầm của hạt ngô. Phức chất có tác dụng ức chế kém hơn phối tử và tốt hơn ion kim loại.
2.6.3. Thăm dò sự ảnh hưởng của phức chất đến hàm lượng protein, proteaza, α- amilaza có trong mầm hạt ngô
2.6.3.1. Phương pháp thí nghiệm
Để xác định một số chỉ tiêu sinh hóa: protein theo phương pháp Lowry, hoạt độ proteaza theo phương pháp Anson cải tiến, hoạt độ α-amilaza theo phương pháp Wohlgemuth chúng tôi tiến hành xây dựng các đường chuẩn: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
* Xây dựng đường chuẩn xác định protein: Dùng ống hút lấy 0,1 ÷ 0,5 ml dung dịch protein huyết thanh bò (0,5 mg/ml) cho vào 5 ống nghiệm đánh số từ 1 đến 5. Cho vào mỗi ống 5 ml dung dịch D (gồm 48 ml dung dịch Na2CO3
2% trong NaOH 0,1N, 1 ml dung dịch CuSO4 0,5% và 1ml dung dịch NaKC4H4O6 1%), thêm nước cất đến cùng thể tích là 9 ml. Lắc đều, để yên 15 phút, bổ sung vào mỗi ống 1 ml dung dịch E (thuốc thử Folin-Ciocalto pha loãng với nước cất tỉ lệ 1:1), lại lắc đều và để yên 30 phút.
Mẫu so sánh không có protein: 5 ml dung dịch D, 4 ml nước và 1 ml dung dịch E. Đo độ hấp thụ quang A của các dung dịch ở bước sóng 750 nm [4]. Kết quả được trình bày ở bảng 2.11, hình 2.18.
Bảng 2.11: Sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang vào khối lƣợng protein
Mẫu 1 2 3 4 5
Khối lượng protein
(huyết thanh bò) (mg) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
đường chuẩn xác định protein
y = 0.1442x + 0.0056 R2 = 0.9347 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 Protein A bs Hình 2.18. Đƣờng chuẩn xác định protein
* Xây dựng đường chuẩn xác định hoạt độ proteaza: Dùng ống hút lấy những thể tích xác định dung dịch chuẩn tyrosin 1 μmol/ml cho vào các bình định mức cỡ 25 ml. Dùng dung dịch HCl 0,2N pha loãng đến vạch để được các dung dịch tyrosin có nồng độ 0,02; 0,04; 0,06; 0,08; 0,1 μmol/ml. Lấy 1 ml ở mỗi ống nghiệm trên cho vào 5 ống nghiệm có đánh số thứ tự, thêm vào mỗi ống 4 ml dung dịch Na2CO3 6%. Lắc đều, thêm vào 1ml thuốc thử Folin-Ciocalteu đã pha loãng 5 lần, để yên 30 phút ở nhiệt độ phòng.
Mẫu so sánh không có tyrosin: 1 ml nước cất, 4 ml dung dịch Na2CO3
6% và 1 ml thuốc thử Folin-Ciocalteu.
Đo độ hấp thụ quang của các dung dịch ở bước sóng 750 nm [4]. Kết quả được trình bày ở bảng 2.12, hình 2.19.
Bảng 2.12. Sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang vào nồng độ tyrosin
Mẫu 1 2 3 4 5
Tyrosin (μmol/ml) 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
đường chuẩn xác định proteaza
y = 2.3915x - 0.0018 R2 = 0.9969 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 Proteaza A bs Hình 2.19. Đƣờng chuẩn xác định proteaza
* Xây dựng đường chuẩn xác định hoạt độ α- amilaza: Dùng ống hút lấy 2, 4, 6, 8, 10 ml dung dịch tinh bột 1% cho vào 5 ống nghiệm đánh số từ 1 đến 5, thêm nước cất đến 10 ml. lấy 0,1ml dung dịch tinh bột ở mỗi ống nghiệm trên cho vào 5 ống nghiệm khác nhau, thêm vào đó 0,1 ml NaCl 0,1%, 0,2 ml dung dịch đệm photphat pH = 6, 0,1 ml nước cất và 0,5ml dung dịch axit sunfosalisilic 20% lắc đều và thêm vào 3ml dung dịch iot đã pha loãng 150 lần.
Mẫu so sánh có thành phần tương tự nhưng không có dung dịch tinh bột. Đo độ hấp thụ quang của các dung dịch ở bước sóng 750 nm [4]. Kết quả được trình bày ở bảng 2.13, hình 2.20.
Bảng 2.13. Sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang vào khối lƣợng tinh bột
Mẫu 1 2 3 4 5
Khối lượng protein
(huyết thanh bò) (mg) 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
A750 0,08 0,19 0,28 0,37 0,48
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn y = 0.49x - 0.014 R2 = 0.9983 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 mg tinh bột m ật độ qu ang Hình 2.20. Đƣờng chuẩn xác định α- amilaza
2.6.3.2. Ảnh hưởng của phức chất đến hàm lượng protein của mầm hạt ngô
Phương pháp thí nghiệm: Cân mỗi mẫu 3 gam mầm hạt ngô, nghiền bằng cối chày sứ, thêm vào mỗi mẫu 10 ml dung dịch đệm photphat có pH = 10, trộn đều, chiết trong 10 giờ ở 4oC lọc và li tâm, lấy phần dịch trong. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lấy mỗi mẫu 0,2 ml dịch chiết cho vào các ống nghiệm có đánh số, thêm vào mỗi ống nghiệm 5 ml dung dịch D, bổ sung thêm nước cất đến cùng thể tích 9 ml, lắc đều, để yên 15 phút. Sau đó lại thêm vào mỗi ống 1 ml dung dịch E, lắc đều và tiếp tục để yên 30 phút.
Mẫu so sánh không có dịch chiết: 5 ml dung dịch D, 4 ml nước và 1 ml dung dịch E.
Đo độ hấp thụ quang của các mẫu thí nghiệm ở bước sóng 750 nm. Đối chiếu với đường chuẩn protein, tính số mg protein có trong mỗi mẫu.
Hàm lượng protein được tính theo công thức : X= 100%
m HSPL a
Trong đó:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
a: Nồng độ thu được khi đo trên máy (mg/ml) HSPL: Hệ số pha loãng
m: Khối lượng mẫu (mg).
Kết quả phân tích hàm lượng protein của hạt ngô khi tác động phức chất H3[Tm(His)3Cl3].3H2O (dựa theo công thức và đường chuẩn hình 2.18) được trình bày ở bảng số 2.14.
Bảng 2.14. Ảnh hƣởng của phức chất Tm(His)3Cl3.3H2O đến hàm lƣợng protein của mầm hạt ngô
Nồng độ phức (ppm) Hàm lƣợng protein (%) % so với đối chứng 0 21,05 100 30 21,43 101,80 60 22,37 106,27 120 23,96 113,82 180 24,68 117,25 240 25,83 122,71
Qua bảng 2.14 thấy rằng: Trong khoảng nồng độ khảo sát từ 30 ppm đến 240 ppm, phức chất H3[Tm(His)3Cl3].3H2O có tác dụng làm tăng hàm lượng protein. Hàm lượng protein tăng theo nồng độ.
2.6.3.3. Ảnh hưởng của phức chất đến hoạt độ proteaza của mầm hạt ngô
Phương pháp thí nghiệm: Cân mỗi mẫu 3 gam mầm cây ngô, nghiền bằng cối chày sứ, thêm vào mỗi mẫu 10 ml dung dịch đệm photphat có pH = 6,5, trộn đều, chiết trong 5 giờ ở 4oC lọc và li tâm, lấy phần dịch trong.
Cho vào mỗi ống nghiệm có đánh số thứ tự 2 ml tyrosin, 1 ml dịch chiết của từng mẫu, lắc đều, để yên ở 300C trong 10 phút. Thêm vào mỗi ống 5 ml axit tricloaxetic 5%, lắc đều, tiếp tục giữ ở 300C trong 30 phút.
Mẫu kiểm tra làm tương tự như trên nhưng cho dung dịch axit tricloaxetic vào trước. Mẫu so sánh thay 2 ml tyrosin bằng nước cất.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Cho vào các ống nghiệm khác 1 ml dung dịch lọc của mỗi mẫu thí nghiệm, mẫu kiểm tra và mẫu so sánh, thêm vào mỗi ống 4 ml dung dịch Na2CO3 6% và 1 ml thuốc thử Folin-Ciocalto đã pha loãng 5 lần, lắc đều và giữ 30 phút ở nhiệt độ phòng.
Đo độ hấp thụ quang của các mẫu thí nghiệm và mẫu kiểm tra ở bước sóng 750 nm. Lấy hiệu số giá trị độ hấp thụ quang giữa mẫu kiểm tra và mẫu thí nghiệm. Dựa vào đồ thị chuẩn proteaza tính lượng μmol tyrosin tương ứng. Từ đó tính đơn vị hoạt độ (ĐVHĐ) của proteaza.
Hoạt độ proteaza được tính theo công thức: ĐVHĐ/mg = m T HSPL k n ) ( Trong đó: ĐVHĐ: Đơn vị hoạt độ
n: Số đo trên máy của mẫu thí nghiệm (mg/ml) k: Số đo trên máy của mẫu kiểm tra (mg/ml) HSPL: Hệ số pha loãng
T: Thời gian ủ enzim với cơ chất m: Khối lượng mẫu (mg)
Kết quả phân tích hàm lượng proteaza của hạt ngô khi tác động phức chất H3[Tm(His)3Cl3].3H2O (dựa theo công thức và đường chuẩn hình 2.19) được trình bày ở bảng số 2.15.
Bảng 2.15. Ảnh hƣởng của phức chất H3[Tm(His)3Cl3].3H2O đến hàm lƣợng proteaza của mầm hạt ngô
Nồng độ phức chất (ppm) Đơn vị hoạt độ (mg/ml) % so với đối chứng 0 0,493 100 30 0,506 102,63 60 0,519 105,27 120 0,525 106,50 180 0,531 107,71 240 0,549 111,36
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Qua bảng 2.15 thấy rằng: Trong khoảng nồng độ khảo sát từ 30 ppm đến 240 ppm, phức chất H3[Tm(His)3Cl3].3H2O có tác dụng làm tăng hàm lượng proteaza. Hàm lượng proteaza tăng theo nồng độ.
2.6.3.4. Ảnh hưởng của phức chất đến hoạt độ α- amilaza của mầm hạt ngô
Phương pháp thí nghiệm: Cân mỗi mẫu 3 gam mầm hạt ngô, nghiền bằng cối chày sứ, thêm vào mỗi mẫu 10 ml dung dịch đệm photphat có pH = 6, trộn đều, chiết trong 5 giờ ở 40C lọc và li tâm, lấy phần dịch trong. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cho vào mỗi ống nghiệm có đánh số thứ tự 1ml dung dịch tinh bột 1%, 1ml dung dịch NaCl 0,1%, 2 ml dung dịch đệm phốt phát 0,05M (pH= 10), lắc đều và giữ ở 30oC trong 15 phút , thêm vào mỗi hỗn hợp 1ml dung dịch chiết của từng mẫu, lắc đều và tiếp tục giữ ở 30oC trong 30 phút sau đó cho 5 ml dung dịch axit sunfusalisilic 20%.
Mẫu so sánh: gồm 1 ml dung dịch chiết của mỗi mẫu thí nghiệm, 9 ml dung dịch iốt đã pha loãng 150 lần.
Đo độ hấp thụ quang A của các dung dịch ở bước sóng 560 nm. Từ đó tính đơn vị hoạt độ (ĐVHĐ) α-amilaza.
Hoạt độ α- amilaza được tính theo công thức: ĐVHĐ/mg = (k n HSPL)
m
Trong đó:
ĐVHĐ: Đơn vị hoạt độ
n: Số đo trên máy của mẫu thí nghiệm (mg/ml) k: Số đo trên máy của mẫu kiểm tra (mg/ml) HSPL: Hệ số pha loãng
m: Khối lượng mẫu (mg)
Kết quả phân tích hàm lượng α- amilaza của hạt ngô khi tác động phức chất H3[Tm(His)3Cl3].3H2O (dựa theo công thức và đường chuẩn hình 2.20) được trình bày ở bảng số 2.16.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 2.16. Ảnh hƣởng của phức chất Tm(His)3Cl3.3H2O đến hàm lƣợng α- amilaza của mầm hạt ngô
Nồng độ phức chất (ppm) Đơn vị hoạt độ (mg/ml) % so với Đối chứng 0 0,0352 100 30 0,0361 102,56 60 0,0373 105,97 120 0,0380 107,95 180 0,0389 110,51 240 0,0396 112,50
Qua bảng 2.16 thấy rằng: Trong khoảng nồng độ khảo sát từ 30 ppm đến 240 ppm, phức chất Tm(His)3Cl3.3H2O có tác dụng làm tăng hàm lượng α- amilaza. Hàm lượng α- amilaza tăng theo nồng độ.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn