Đây cũng là phương pháp thuận tiện, được áp dụng rộng rãi để nghiên cứu phức chất. Nguyên tắc của phương pháp là: xác lập một số trị số trung bình mà độ dẫn điện mol (μ) hoặc độ dẫn điện đương lượng (λ) của dung dịch phức chất dao động xung quanh chúng. Các giá trị này sẽ đặc trưng cho tính chất điện li của các phân tử phức chất trong dung dịch.
Khi nghiên cứu phức chất bằng phương pháp này, trước tiên ta xác định độ dẫn điện riêng χ của dung dịch cần nghiên cứu ở một nhiệt độ nhất định, từ đó ta tính được độ dẫn điện mol phân tử μ hoặc độ dẫn điện đương lượng λ.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Đo độ dẫn điện mol là độ dẫn điện của dung dịch chứa một mol hợp chất phức chất, đặt giữa hai điện cực song song cách nhau 1 cm. Còn gọi là độ dẫn điện mol phân tử và được tính theo công thức:
= .1000
M C
(Ω-1.cm2.mol-1 ) Độ dẫn điện đương lượng λ (Ω-1
.cm2. đlg-1) tính theo công thức: λ = .1000 N C (Ω-1.cm2. đlg-1 ) Trong đó:
: độ dẫn điện riêng của dung dịch (Ω-1.cm-1) CM : nồng độ mol/l của dung dịch (M)
CN: nồng độ đương lượng của dung dịch (N)
Nhờ phép đo độ dẫn điện dung dịch có thể tìm được số lượng ion mà phức chất phân li ra, từ đó giới hạn số lượng công thức giả định khi nghiên cứu cấu trúc của một phức chất mới.
Khi áp dụng các định luật đặc trưng của chất điện li mạnh thông thường cho phức chất có sự tương ứng gần đúng là cùng nồng độ dung dịch 10-3mol/l ở 250C những phức chất phân li thành hai ion trong dung dịch sẽ có độ dẫn điện mol gần 100 (Ω-1
.cm2.mol-1), những phức chất phân li thành 3, 4 và 5 ion sẽ có độ dẫn điện mol khoảng 250, 400 và 500 (Ω-1
.cm2.mol-1). Đối với phức chất có bản chất trung hoà điện thì độ dẫn điện rất bé [6].
Độ dẫn điện của dung dịch phức chất phụ thuộc vào các yếu tố sau:
Bản chất của ion trung tâm
Bản chất của phối tử
Cấu tạo của ion phức
Dung lượng phối trí của các phối tử
Các phức chất mà phân tử của chúng có các vòng 5 hoặc 6 cạnh đều rất bền. Vì vậy độ dẫn điện của dung dịch của chúng thực tế không thay đổi theo thời gian và nhỏ hơn độ dẫn điện của dung dịch phức chất không vòng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Dựa theo kết quả đo độ dẫn điện ở một chừng mực nào đấy có thể suy đoán về độ bền tương đối của các phức chất có cùng kiểu cấu tạo với nhau. Đối với các phức chất có cùng kiểu cấu tạo thì dung dịch của phức chất nào có độ dẫn điện lớn hơn sẽ kém bền hơn [6].
1.6. Đối tƣợng thăm dò hoạt tính sinh học của phức chất
1.6.1. Giới thiệu về vi khuẩn Salmonella, vi khuẩn Shigella, vi khuẩn Escherichia coli và vi khuẩn Staphylococcus aureus
Vi khuẩn (bacterium, bacteria) đôi khi còn được gọi là vi trùng, nó thuộc loại ký sinh trùng. Vi khuẩn là một nhóm sinh vật đơn bào, có kích thước nhỏ và thường có cấu trúc tế bào đơn giản không có nhân, bộ khung tế bào và các bào quan như ty thể và lục lạp.
Salmonella là loại trực khuẩn gram âm (hình 1.1), có lông, có sức đề kháng tốt ở ngoại cảnh. Trong đất sống được vài tháng, trong nước sống được vài tuần, trong thực phẩm đông lạnh được 2 - 3 tháng và sống cả ở những thực phẩm có nồng độ muối cao, ở 1000oC phải hơn 5 phút mới diệt được.
Shigella là trực khuẩn gram âm (hình 1.2), không di động. Đây là giống vi khuẩn có tế bào chủ đặc biệt, chúng chỉ thích nghi và phát triển trong tế bào chủ là người và các loài linh trưởng. Chúng có thể tồn tại 6 tháng trong môi trường nước.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Vi khuẩn có thể có ích hoặc có hại cho môi trường, động vật, cả con người. Vai trò của vi khuẩn trong gây bệnh và truyền bệnh rất quan trọng. Một số là tác nhân gây bệnh (pathogen) và gây ra bệnh uốn ván (tetanus), sốt thương hàn (typhoid fever), giang mai (syphilis), tả (cholera), bệnh lây qua thực phẩm (foodborne illness) và lao (tuberculosis). Ở thực vật, vi khuẩn gây mụn lá, và héo cây. Các hình thức lây nhiễm gồm qua tiếp xúc, không khí, thực phẩm, nước và côn trùng.
Salmonella xâm nhập cơ thể qua đường miệng và hầu hết là do ăn phải thức ăn bị nhiễm như thực phẩm, sữa, nước uống. Nhiễm Salmonella có thể dẫn tới sốt thương hàn, nhiễm khuẩn máu, viêm ruột. Bệnh thương hàn có triệu chứng ban đầu là sốt kèm theo lạnh run, sốt tăng dần kéo dài trong 2 tuần, gây ra suy nhược, biếng ăn, mệt mỏi, gan lách to, xuất huyết ngoài da, lượng bạch cầu giảm. Có thể nói đây là một trong các bệnh có nhiều biến chứng nguy hiểm nhất trong số các bệnh lây truyền qua đường tiêu hóa.
Shigella chủ yếu gây nên bệnh lị trực trùng. Thời gian ủ bệnh từ 1 - 7 ngày. Các biểu hiện nghiêm trọng khi nhiễm Shigella là: tiêu ra máu, mất nước, sốt cao, bị co rút thành bụng. Những triệu chứng này có thể kéo dài 12 - 14 ngày hoặc lâu hơn. Bệnh biểu hiện rất nghiêm trọng đối với trẻ em và người già. Hàng năm trên thế giới có khoảng nữa triệu người chết vì Shigella. Đường lây nhiễm chủ yếu là đường miệng và nước là môi trường truyền bệnh quan trọng [3][4].
Escherichia coli (thường được viết tắt là E.coli) là một loại khuẩn gram âm (hình 1.3), được gọi là trực khuẩn. Chúng sống ký sinh trong đường ruột của động vật máu nóng (bao gồm chim và động vật có vú). Vi khuẩn này cần thiết trong quá trình tiêu hoá thức ăn và là thành phần của khuẩn lạc ruột.
E.coli thuộc họ vi khuẩn Enterchacteviaceae và thường được sử dụng làm sinh vật mô hình cho các nghiên cứu về vi khuẩn [3] [4].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Staphylococcus aureus (thường được viết tắt là Sta) là một loại khuẩn gram dương, được gọi là cầu khuẩn vì nó có dạng hình cầu. Vi khuẩn Sta đứng tụ thành từng đám giống như chùm nho và thành từng đàn lớn, tròn, màu vàng (hình 1.4). Sta là loại khuẩn gram dương, có khoảng 2600 gen và 2,8 triệu ADN trong nhiễm sắc thể của nó.
Hình 1.3: Hình thái vi khuẩn E.coli Hình 1.4: Hình thái vi khuẩn Sta
Trong tự nhiên vi khuẩn Sta có mặt ở khắp nơi: không khí, đất, nước, là vi khuẩn hội sinh gặp thường xuyên ở da và các hốc tự nhiên của người và động vật. Cầu khuẩn thường gây nên các yếu tố sau: tan máu, đông huyết tương, gây hoại tử da, gây nhiễm độc thức ăn và viêm ruột, hủy diệt bạch cầu. Loại khuẩn này chủ yếu gây bệnh cấp tính như nhiễm trùng có mủ, nhiễm trùng máu... [3] [4].
Trên cơ sở tìm hiểu, thấy rõ vai trò của các đối tượng nêu trên đối với cuộc sống, chúng tôi nhận thấy: Việc tìm ra một chất có tác dụng ức chế hay kích thích sự phát triển tính kháng khuẩn đối với các vi khuẩn có ý nghĩa quan trọng. Vì vậy, sau khi tổng hợp, nghiên cứu thành phần và cấu trúc của phức chất, chúng tôi tiến hành nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của phức Tm(His)3Cl3.3H2O lên các đối tượng: vi khuẩn Salmonella và vi khuẩn Shigella; vi khuẩn Escherichia coli và vi khuẩn Staphylococcus aureus.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
1.6.2. Giới thiệu về cây ngô, protein, proteaza và α- amilaza
1.6.2.1. Giới thiệu về cây ngô
Ngô có tên khoa học là Zea mays. L, có giá trị kinh tế về nhiều mặt: dùng làm lương thực cho con người, làm thức ăn chăn nuôi gia súc, dùng làm thực phẩm (bao tử ngô), đặc biệt ngô còn cung cấp nguyên liệu cho ngành công nghiệp. Do đó ngô đã trở thành cây trồng quan trọng.
Trên thế giới, ngô là một trong những cây ngũ cốc quan trọng, diện tích đứng thứ 3 sau lúa mì và lúa nước; sản lượng thứ hai và năng suất cao nhất trong các cây ngũ cốc. Năm 1961, diện tích ngô toàn thế giới đạt 105,5 triệu ha, năng suất 19,4 tạ/ha, sản lượng 205 triệu tấn, đến năm 2009, diện tích trồng ngô thế giới đạt khoảng 159,5 triệu ha, năng suất bình quân 51,3 tạ/ha, sản lượng 817,1 triệu tấn. Trong đó Mỹ, Trung Quốc, Braxin là những nước đứng đầu về diện tích và sản lượng.
Ở Việt Nam, ngô là cây lương thực quan trọng thứ hai sau cây lúa và là cây màu quan trọng nhất được trồng ở nhiều vùng sinh thái khác nhau, đa dạng về mùa vụ gieo trồng và hệ thống canh tác. Cây ngô không chỉ cung cấp lương thực cho người, vật nuôi mà còn là cây trồng xóa đói giảm nghèo tại các tỉnh có điều kiện kinh tế khó khăn. Sản xuất ngô cả nước qua các năm không ngừng tăng về diện tích, năng suất, sản lượng: năm 2001 tổng diện tích ngô là 730.000 ha, đến năm 2005 đã tăng trên 1 triệu ha; năm 2010, diện tích ngô cả nước 1126,9 nghìn ha, năng suất 40,9 tạ/ha, sản lượng trên 4,6 triệu tấn. Tuy vậy, cho đến nay sản xuất ngô ở nước ta phát triển chưa tương xứng với tiềm năng, chưa đáp ứng được nhu cầu tiêu dùng trong nước, hàng năm nước ta vẫn phải nhập khẩu từ trên dưới 1 triệu tấn ngô hạt.
Hạt ngô được cấu tạo bởi tinh bột, chất đạm, chất béo, chất xơ, chất khoáng, ngoài ra còn chứa các loại enzim điều khiển mọi quá trình sinh hóa xảy ra trong hạt [7].
Ngô là loại cây hàng năm ra quả một lần, thường phát triển vào mùa xuân. Vòng đời thay đổi tùy theo điều kiện sống. Thời kỳ sinh trưởng và phát
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
triển của ngô qua 13 thời kỳ: trương hạt; nảy mầm; nhú mầm; thời kỳ lá thứ ba; thời kỳ lá thứ năm; thời kỳ đẻ nhánh; thời kỳ đậm thân; thời kỳ lá thứ 7, thứ 9 và lá thứ 11; thời kỳ trổ cờ; thời kỳ phun râu; thời kỳ chín sữa, chín sáp và cuối cùng là thời kỳ chín hoàn toàn. Trong đó thời kỳ nảy mầm là nhạy cảm nhất với tác động bên ngoài. Thời kỳ này có ý nghĩa quan trọng, quyết định sự sinh trưởng, phát triển dẫn đến năng suất của ngô. Chính vì vậy mà chúng tôi tiến hành thí nghiệm thăm dò ảnh hưởng của phức chất Tm(His)3Cl3.3H2O đến sự nảy mầm và phát triển mầm, rễ của hạt ngô [5].
1.6.2.2. Giới thiệu về protein, proteaza và α- amilaza
- Protein: là các polime có khối lượng phân tử lớn, chủ yếu bao gồm các L-amino axit kết hợp với nhau qua liên kết peptit. Protein là thành phần không thể thiếu được của tất cả các cơ thể sinh vật nhưng lại có tính đặc thù cao cho loài, từng cá thể của cùng một loài, từng cơ quan, mô của cùng một cá thể. Protein rất đa dạng về cấu trúc và chức năng, là nền tảng về cấu trúc và chức năng của cơ thể sống. Có thể kể đến một số chức năng quan trọng của protein như: xúc tác, vận tải chuyển động, bảo vệ, truyền xung thần kinh, điều hòa, kiến tạo chống đỡ cơ học, dự trữ năng lượng…
Tất cả các protein đều chứa các nguyên tố C, H, O, N, một số còn có một lượng nhỏ S. Ngoài các nguyên tố trên, protein còn chứa một lượng rất ít các nguyên tố khác như P, Fe, Zn, Cu, Mn, Ca,… [2].
- Enzim proteaza (peptit - hidrolaza 3.4) xúc tác quá trình thủy phân liên kết peptit (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptit đến sản phẩm cuối cùng là các axit amin. Ngoài ra, nhiều proteaza cũng có khả năng thủy phân liên kết este và vận chuyển axit amin.
- Proteaza cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm, virut) đến thực vật (đu đủ, dứa…) và
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
động vật (gan, dạ dày bê…). Trong cơ thể, các proteaza đảm nhiệm nhiều chức năng sinh lý như: hoạt hóa zymogen, đông máu và phân hủy sợi fibrin của cục máu đông, giải phóng hormon và các peptit có hoạt tính sinh học từ các tiền chất, vận chuyển protein qua màng…. Ngoài ra, các proteaza có thể hoạt động như các yếu tố phát triển của cả tế bào ác tính và tế bào bình thường đó là tăng sự phân chia tế bào, sinh tổng hợp AND…[2].
- α-amilaza: được tìm thấy trong hạt cây một và hai lá mầm, được chia thành 2 loại: α- amilaza và β-amilaza. Cơ chất của chúng là tinh bột và oligosacharide.
α - amilaza thuộc nhóm hiđrolase có trong cơ thể động vật (nước bọt, tụy tạng), thực vật (hạt hoà thảo nảy mầm), nấm mốc, vi khuẩn. α - amilaza phân giải các liên kết 1,4- glicozit ở giữa chuỗi mạch polisaccazit tạo thành các đextrin phân tử thấp. Do đó dưới tác dụng của enzim này làm dung dịch tinh bột nhanh chóng bắt màu với dung dịch iốt và bị giảm độ nhớt mạnh, ion canxi có tác dụng làm bền cấu trúc không gian của phân tử enzim. α - amilaza tương đối bền với nhiệt hơn so với các amilaza khác và kém bền với các axit [2].
Các yếu tố trên quyết định đến sinh trưởng, phát triển, năng suất và hàm lượng dinh dưỡng của hạt ngô. Do đó chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của phức chất đến hàm lượng protein, proteaza, α- amilaza có trong mầm hạt ngô.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chƣơng 2
THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 2.1. Hóa chất và thiết bị
2.1.1. Hóa chất
2.1.1.1. Dung dịch đệm pH = 4,2 (CH3COONH4, CH3COOH)
Lấy 3,99ml CH3COOH 60,05%, d=1,05 g/ml hòa tan vào 150ml nước cất hai lần trong bình định mức 250ml. Lấy 0,5ml NH3 25%, d=0,88 g/ml hòa tan trong 40ml nước cất hai lần rồi cho vào bình định mức trên, thêm nước cất hai lần đến vạch định mức ta được dung dịch đệm có pH = 4,2 (kiểm tra lại bằng máy đo pH).
2.1.1.2. Dung dịch asenazo (III) 0,1%
Cân một lượng chính xác asenazo (III) trên cân điện tử 4 số. Dùng nước cất hai lần hòa tan sơ bộ, nhỏ từng giọt Na2CO3 0,1% cho đến khi dung dịch có màu xanh tím. Đun nóng hỗn hợp ở 60oC, tiếp theo nhỏ từng giọt axit HCl loãng cho đến khi dung dịch có màu tím đỏ và định mức đến thể tích cần thiết.
2.1.1.3. Dung dịch DTPA 10-3M (đietylen triamin pentaaxetic)
Cân lượng chính xác DTPA (M= 393,35 g.mol-1) trên cân điện tử 4 số, hòa tan bằng nước cất hai lần, định mức đến thể tích cần thiết.
2.1.1.4. Dung dịch LnCl3 10-2M (Ln: Tm, Yb, Lu)
Các dung dịch này được điều chế từ các oxit tương ứng như sau: cân chính xác một lượng oxit Tm2O3, Yb2O3, Lu2O3 theo tính toán trên cân điện tử 4 số, hòa tan bằng dung dịch axit HCl 1N (được pha từ ống chuẩn). Cô cạn trên bếp cách thủy ở 80oC, sau đó hòa tan bằng nước cất hai lần và định mức đến thể tích xác định. Dùng phương pháp chuẩn độ complexon với chất chuẩn là DTPA 10-3M, thuốc thử asenazo (III) 0,1%, đệm pH = 4,2 để xác định lại nồng độ ion đất hiếm.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.1.1.5. Dung dịch L- histidin 10-3M
Cân chính xác lượng L- histidin trên cân điện tử 4 số, sau đó hòa tan và định mức bằng nước cất hai lần đến thể tích cần thiết.
2.1.1.6. Dung dịch thuốc thử folin-xicanto
Chuẩn bị bình cầu đáy tròn co dung tích một lít, có lắp ống sinh hàn ngược: 700 ml nước cất, 100 g Na2W2O4.2H2O (natrivonframat) và 25g Na2Mo2O4.2H2O (natrimolipdat), 50ml dung dịch axit H3PO4 85%, 100 ml dung dịch HCl đặc. Lắp ống sinh hàn ngược vào bình sôi trong 10 giờ, sau đó thêm 150 gam Li2SO4.2H2O, 50ml nước cất và vài giọt brôm, lắc đều tiếp tục đun 15 phút không có ống sinh hàn để loại bỏ brôm dư. Làm lạnh và thêm nước cất đến một lít thu được dung dich