Sau thời gian 4-5 tháng, sử dụng nguồn vật liệu AM đã cộng sinh với rễ làm nguyên liệu AM vô trùng tạo cộng sinh với rễ in vitro trong bước tiếp theo với mục tiêu nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro. Các bước tiến hành như sau:
- Trên đĩa thạch chứa môi trường, cắt bỏ mảnh thạch ở phần chính giữa đĩa. - Trên đĩa thạch chứa vật liệu AM vô trùng đã nảy mầm, cắt lấy AM sao cho mảnh nguyên liệu nằm trọn bên trong phần thạch đã loại bỏ ở đĩa môi trường. Dùng dao cẩn thận chuyển vật liệu AM đặt vừa vào phần thạch vừa loại bỏ trên môi trường MSR (the modified Strullu Romand) (Strullu and Romand 1986, Declerck, Stullu et al. 1998). Cấy chuyển đoạn rễ in vitro lên đĩa thạch chứa AM sao cho chiều hướng phát triển của rễ mới sẽ chạm sợi nấm.
- Nuôi cấy trong điều kiện thích hợp, trong tối, ở 270C. Theo dõi tiến triển của rễ, sợi nấm, cộng sinh và sinh bào tử mới trên đĩa cấy.
2.3.6. Phương pháp thu thập, phân tích và xử lý thống kê số liệu thí nghiệm
a. Phương pháp thu thập số liệu
Số lượng bào tử (bt/đĩa petri): Đếm trực tiếp bằng quan sát trên kính hiển vi
soi nổi trên các ô đếm được thiết kế sẵn, tổng các ô quan sát bằng 2/3 diện tích đĩa petri, thu số lượng bào tử ở các khoảng thời gian 1 tháng, 2 tháng, 3 tháng, 4 tháng và 5 tháng sau khi tiến hành cộng sinh giá thể rễ với chủng AM tương ứng, trong báo cáo này các khoảng thời gian trên được gọi tắt tương ứng là T1, T2, T3, T4 và T5.
b. Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu thu được sẽ được xử lý thống kê bằng phần mềm SPSS 20. So sánh ý nghĩa khác biệt các giá trị trung bình của các công thức thí nghiệm bằng phân tích ANOVA Post Hoc Multiple Comparison Test theo tiêu chuẩn Bonferroni và Duncan nếu phương sai bằng nhau và Tamhane‘s T2 nếu phương sai không bằng nhau, p<0,05 được xem là có ý nghĩa.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả tạo vật liệu giá thể mô rễ in vitro
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.1: Rễ Cà rốt không có gen Ri-tDNA (a) Rễ Cà rốt có gen Ri-tDNA (b)
Bằng các phương pháp thí nghiệm và kỹ thuật khử trùng bề mặt hạt, kỹ thuật nuôi cấy trên môi trường thạch agar, chúng tôi đã tạo được vật liệu giá thể rễ Cà rốt (Daucus carrota L.) và Medicago (Medicago truncatula) in vitro không có gen Ri-tDNA để sử dụng cho các nghiên cứu của đề tài.
Bằng kỹ thuật đồng nuôi cấy với A. rhizogenes trên môi trường MS 0,5 % agar, và sau đó môi trường MS 0,5 % bổ sung 500 mg Canbenicilin/lít để chọn lọc và loại bỏ vi khuẩn A. rhizogenes, chúng tôi đã nghiên cứu tạo được vật liệu giá thể rễ Cà rốt (Daucus carrota L.) in vitro chuyển gen Ri-tDNA hoàn toàn sạch khuẩn. Vật liệu giá thể rễ Cà rốt (Daucus carrota L.) in vitro chuyển gen Ri-tDNA được khẳng định về mặt di truyền bằng phản ứng PCR. Kết quả PCR xác định trong bộ gen của các giá thể mô rễ Cà rốt invitro này đều phát hiện thấy có các gen rolB và rolC của vi khuẩn A. rhizogenses (có trên đoạn T-DNA) ở các vị trí khoảng 380bp (cho gen rolB) và 580bp (cho gen rolC) (Hình 3.2), đây là vị trí biểu hiện sự có mặt hay không có mặt của 2 gen rolB và rolC trong cây chuyển gen Ri-tDNA
(Veena and Taylor 2007) còn trên cây đối chứng (không chuyển gen) thì không thấy có sự xuất hiện của 2 gen này. Như vậy về mặt di truyền đã khẳng định là các giá thể mô rễ Cà rốt invitro này đã được chuyển gen Ri-tDNA từ vi khuẩn A.
rhizogenes thông qua đồng nuôi cấy.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.3: Rễ Medicago không có gen Ri-tDNA (a) Rễ Medicago có gen Ri-tDNA (b)
3.2. Đánh giá ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro
Bảng 3.1: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh AM
in vitro giữa chủng 41833 với giá thể rễ Cà rốt chuyển gen Ri-tDNA
Công thức Số lƣợng bào tử
T1 T2 T3 T4 T5
CT1 1809a ± 47 3453a ± 62 5057a ± 43 8938a ± 64 10363a ± 77
CT2 147b ± 8 263b ± 6 330b ± 10 402b ± 3 636b ± 8
CT3 644c ± 9 1226c ± 14 1465c ± 24 1805c ± 8 2021c ± 17
Post Hoc Test: Giá trị trong cùng cột thời gian có chữ cái giống nhau là khác biệt không ý nghĩa, α=0,05 CT1: MSR 0,5% agar CT2: MSR lỏngCT3: MS 0,5% agar
T1: tháng thứ nhất, T2: tháng thứ 2, T3: tháng thứ 3; T4: tháng thứ 4, T5: tháng thứ 5
Sau thời gian 5 tháng tiến hành bố trí và theo dõi thí nghiệm, kết quả ở Bảng 3.1 cho thấy, từ tháng thứ nhất đến tháng thứ năm số lượng bào tử trung bình cao
Hình 3.2: Phân tích PCR cho mô rễ Cà rốt chuyển gen Ri-tDNA và không chuyển gen Ri-tDNA. Băng 1: có gen rolB; băng 2: có gen rolC (cho mẫu chuyển gen); băng 3 và 4: không có gen rolB và rolC (cho mẫu không chuyển gen); M: DNA
thang chuẩn 100 bp (Fermentas)
580 bp 380 bp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
nhất thu được là ở CT1. Số lượng bào tử sản sinh ở mức độ bình thường trong các tháng thứ nhất, tháng thứ hai và tháng thứ ba, sản sinh nhiều nhất ở tháng thứ tư, và sau đó giảm dần ở tháng thứ năm. Trong tháng thứ 5 (tháng cuối), số lượng bào tử đạt cao nhất ở CT1 (trung bình đạt 10363 bào tử/petri), tiếp theo là CT3 (2021 bào tử/petri) và thấp nhất ở CT2 (chỉ đạt trung bình 636 bào tử/petri).
Kết quả phân tích Post Hoc Test về ý nghĩa khác biệt của số lượng bào tử trong các công thức thí nghiệm cho thấy rằng, số lượng bào tử giữa các công thức thí nghiệm CT1, CT2 và CT3 khác biệt có ý nghĩa (α=0,05) trong tất cả các tháng thí nghiệm từ T1 đến T5. Điều này có nghĩa rằng, yếu tố thí nghiệm môi trường nuôi cấy đã ảnh hưởng quan trọng tới sự sản sinh bào tử in vitro của chủng 41833 cộng sinh với giá thể rễ Cà rốt có gen Ri-tDNA.
Biểu đồ 3.1:Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh AM
in vitro giữa chủng 41833 với giá thể rễ Cà rốt chuyển gen Ri-tDNA
Bảng 3.2:Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh AM in
vitro giữa chủng M7 với giá thể rễ Cà rốt chuyển gen Ri-tDNA
Công thức Số lƣợng bào tử T1 T2 T3 T4 T5 CT1 2061a ± 45 4031a ± 8 7055a ± 12 9238a ± 31 9948a ± 31 CT2 120c ± 3 252c ± 3 308c ± 6 493c ± 13 575c ± 14 CT3 722b ± 5 1245b ± 32 1455b ± 18 1804b ± 8 2049b ± 40
Post Hoc Test: Giá trị trong cùng cột thời giancó chữ cái giống nhau là khác biệt không ý nghĩa, α=0,05 CT1: MSR 0,5% agar CT2: MSR lỏng CT3: MS 0,5% agar T1: tháng thứ nhất, T2: tháng thứ 2, T3: tháng thứ 3; T4: tháng thứ 4, T5: tháng thứ 5 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 CT1 CT2 CT3 10363 636 2021 Số lƣợn g bào tử/ dia pet ri Cà rốt - 41833
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Sau thời gian 5 tháng tiến hành bố trí và theo dõi thí nghiệm, kết quả ở Bảng 3.2 cho thấy, từ tháng thứ nhất đến tháng thứ năm số lượng bào tử trung bình cao nhất thu được là ở CT1. Số lượng bào tử sản sinh ở mức độ bình thường trong các tháng thứ nhất, tháng thứ hai và tháng thứ ba, sản sinh nhiều nhất ở tháng thứ tư, và sau đó giảm dần ở tháng thứ năm. Trong tháng thứ 5 (tháng cuối), số lượng bào tử đạt cao nhất ở CT1 (trung bình đạt 9948 bào tử/petri), tiếp theo là CT3 (2049 bào tử/petri) và thấp nhất ở CT2 (chỉ đạt trung bình 575 bào tử/petri).
Kết quả phân tích Post Hoc Test về ý nghĩa khác biệt của số lượng bào tử trong các công thức thí nghiệm cho thấy rằng, số lượng bào tử giữa các công thức thí nghiệm CT1, CT2 và CT3 khác biệt có ý nghĩa (α=0,05) trong tất cả các tháng thí nghiệm từ T1 đến T5. Điều này có nghĩa rằng, yếu tố thí nghiệm môi trường nuôi cấy đã ảnh hưởng quan trọng tới sự sản sinh bào tử in vitro của chủng M7 cộng sinh với giá thể rễ Cà rốt có gen Ri-tDNA.
Biểu đồ 3.2:Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh AM
in vitro giữa chủng M7 với giá thể rễ Cà rốt chuyển gen Ri-tDNA
Bảng 3.3:Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh AM in
vitro giữa chủng 41833 với giá thể rễ Medicago chuyển gen Ri-tDNA
Công thức Số lƣợng bào tử T1 T2 T3 T4 T5 CT1 1632a ± 11 3354a ± 25 4025a ± 52 7110a ± 16 8271a ± 12 CT2 81c± 5 169c± 5 217c± 5 288c± 6 407c± 6 CT3 408b ± 6 1056b ± 36 1250b ± 12 1411b ± 8 1740b ± 6
Post Hoc Test: Giá trị trong cùng cột thời giancó chữ cái giống nhau là khác biệt không ý nghĩa, α=0,05 CT1: MSR 0,5% agar CT2: MSR lỏng CT3: MS 0,5% agar T1: tháng thứ nhất, T2: tháng thứ 2, T3: tháng thứ 3; T4: tháng thứ 4, T5: tháng thứ 5 0 2000 4000 6000 8000 10000 CT1 CT2 CT3 9948 575 2049 Số lƣợng bà o tử/dia pet ri Cà rốt - M7
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Sau thời gian 5 tháng tiến hành bố trí và theo dõi thí nghiệm, kết quả ở Bảng 3.3 cho thấy, từ tháng thứ nhất đến tháng thứ năm số lượng bào tử trung bình cao nhất thu được là ở CT1. Số lượng bào tử sản sinh ở mức độ bình thường trong các tháng thứ nhất, tháng thứ hai và tháng thứ ba, sản sinh nhiều nhất ở tháng thứ tư, và sau đó giảm dần ở tháng thứ năm. Trong tháng thứ 5 (tháng cuối), số lượng bào tử đạt cao nhất ở CT1 (trung bình đạt 8271 bào tử/petri), tiếp theo là CT3 (1740 bào tử/petri) và thấp nhất ở CT2 (chỉ đạt trung bình 407 bào tử/petri).
Kết quả phân tích Post Hoc Test về ý nghĩa khác biệt của số lượng bào tử trong các công thức thí nghiệm cho thấy rằng, số lượng bào tử giữa các công thức thí nghiệm CT1, CT2 và CT3 khác biệt có ý nghĩa (α=0,05) trong tất cả các tháng thí nghiệm từ T1 đến T5. Điều này có nghĩa rằng, yếu tố thí nghiệm môi trường nuôi cấy đã ảnh hưởng quan trọng tới sự sản sinh bào tử in vitro của chủng 41833 cộng sinh với giá thể rễ Medicago có gen Ri-tDNA.
Biểu đồ 3.3:Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh AM
in vitro giữa chủng 41833 với giá thể rễ Medicago chuyển gen Ri-tDNA
Bảng 3.4:Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh AM in
vitro giữa chủng M7 với giá thể rễ Medicago chuyển gen Ri-tDNA
Công thức Số lƣợng bào tử T1 T2 T3 T4 T5 CT1 1949a ± 23 3656a ± 39 5873a ± 74 8266a ± 75 9229a ± 29 CT2 104c ± 3 218c ± 6 254c ± 6 406c ± 7 457c ± 6 CT3 548b ± 8 1123b ± 4 1356b ± 13 1704b ± 12 1827b ± 10
Post Hoc Test: Giá trị trong cùng cột thời giancó chữ cái giống nhau là khác biệt không ý nghĩa, α=0,05 CT1: MSR 0,5% agar CT2: MSR lỏng CT3: MS 0,5% agar T1: tháng thứ nhất, T2: tháng thứ 2, T3: tháng thứ 3; T4: tháng thứ 4, T5: tháng thứ 5 0 2000 4000 6000 8000 10000 CT1 CT2 CT3 8271 407 1740 Số lƣợn g bào tử/ pet ri Medicago - 41833
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Sau thời gian 5 tháng tiến hành bố trí và theo dõi thí nghiệm, kết quả ở Bảng 3.4 cho thấy, từ tháng thứ nhất đến tháng thứ năm số lượng bào tử trung bình cao nhất thu được là ở CT1. Số lượng bào tử sản sinh ở mức độ bình thường trong các tháng thứ nhất, tháng thứ hai và tháng thứ ba, sản sinh nhiều nhất ở tháng thứ tư, và sau đó giảm dần ở tháng thứ năm. Trong tháng thứ 5 (tháng cuối), số lượng bào tử đạt cao nhất ở CT1 (trung bình đạt 9229 bào tử/petri), tiếp theo là CT3 (1827 bào tử/petri) và thấp nhất ở CT2 (chỉ đạt trung bình 457 bào tử/petri).
Kết quả phân tích Post Hoc Test về ý nghĩa khác biệt của số lượng bào tử trong các công thức thí nghiệm cho thấy rằng, số lượng bào tử giữa các công thức thí nghiệm CT1, CT2 và CT3 khác biệt có ý nghĩa (α=0,05) trong tất cả các tháng thí nghiệm từ T1 đến T5. Điều này có nghĩa rằng, yếu tố thí nghiệm môi trường nuôi cấy đã ảnh hưởng quan trọng tới sự sản sinh bào tử in vitro của chủng M7 cộng sinh với giá thể rễ Medicago có gen Ri-tDNA.
Biểu đồ 3.4:Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh AM
in vitro giữa chủng M7 với giá thể rễ Medicago chuyển gen Ri-tDNA
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 CT1 CT2 CT3 9229 457 1827 Số lƣợn g bào tử/ pet ri Medicago - M7
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình3.4: Rễ cộng sinh phát triển trên môi trường MSR đặc (a), trên môi trường MSR lỏng (b), trên môi trường MS đặc (c)
Kết quả số lượng bào tử thu được trong thí nghiệm môi trường sau 5 tháng tiến hành thí nghiệm trên 4 loại giá thể Cà rốt-41833, Cà rốt-M7, Medicago-41833, Medicago-M7 tương đương với những kết quả nghiên cứu trước đây (Declerck, D‘Or et al. 2001) về môi trường nuôi cấy AM in vitro. Kết quả ở CT1 cho thấy, môi trường MSR có bổ sung 0,5% agar phù hợp hơn cho nuôi cấy AM so với môi trường cùng loại MSR lỏng bởi AM cần có sự cố định tốt để phát triển, so với môi trường MS, thành phần dinh dưỡng trong MSR đã được biến đổi với mục đích tối ưu hóa cho sự phát triển của AM, hạn chế một số chất gây ức chế sự cộng sinh. Môi trường MS tốt cho sự sinh trưởng của rễ, do đó giảm sự phụ thuộc của rễ vào quan hệ cộng sinh với AM, từ đó làm giảm mức độ cộng sinh nấm - rễ. Trong nghiên cứu này, chúng tôi cần lựa chọn được loại môi trường tối ưu cho khả năng nhân sinh khối cộng sinh AM. Vì vậy, môi trường MSR có bổ sung 0,5% agar là loại môi trường được lựa chọn và sử dụng cho những thí nghiệm nghiên cứu tiếp theo.
Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng, sử dụng môi trường MSR không có đường cho kết quả cộng sinh AM tốt hơn khi sử dụng môi trường MSR có bổ sung đường (Ijdo, Cranenbrouck et al. 2011). Tuy nhiên, trong phương pháp này, Ijdo và cộng sự đã sử dụng đĩa petri có cấu trúc 2 ngăn, trong đó, một ngăn có bổ sung đường để cung cấp dinh dưỡng cho giá thể rễ phát triển, ngăn còn lại là môi trường không đường cho sự phát triển của nấm, đồng thời có sự bổ sung môi trường theo từng đợt. Việc áp dụng phương pháp này còn hạn chế ở Việt Nam do vấn đề về việc cần đầu tư trang thiết bị rất tốn kém và yêu cầu cao về công nghệ. Do vậy, kết quả
b c
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
nghiên cứu của chúng tôi là phù hợp với việc tiếp cận nghiên cứu theo hướng kỹ thuật đơn giản.
3.3. Đánh giá ảnh hƣởng của pH môi trƣờng nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro
Bảng 3.5:Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh
AM in vitro giữa chủng 41833 với giá thể rễCà rốt chuyển gen Ri-tDNA
Công thức Số lƣợng bào tử T1 T2 T3 T4 T5 CT1 1108b± 25 2127c ± 20 3147c ± 14 4216c ± 17 5412c ± 7 CT2 1809a ± 47 3453a ± 60 5057a ± 43 8938a ± 64 10363a ± 78 CT3 1025b ± 8 2523b ± 18 4357b ± 31 6164b ± 71 7138b ± 14
Post Hoc Test: Giá trị trong cùng cột thời giancó chữ cái giống nhau là khác biệt không ý nghĩa, α=0,05 CT1: pH = 5,0 CT2: pH = 5,5CT3: pH = 6,0
T1: tháng thứ nhất, T2: tháng thứ 2, T3: tháng thứ 3; T4: tháng thứ 4, T5: tháng thứ 5
Sau thời gian 5 tháng tiến hành bố trí và theo dõi thí nghiệm, kết quả ở Bảng