a. Tạo vật liệu mô rễ không chuyển gen Ri-tDNA(Abdoulaye 2003, Chabaud et al. 2006)
Hình 2.1: Gieo hạt Medicago (a)
Rễ Medicago phát triển sau 5 ngày (b)
- Hạt Cà rốt và Medicago đều được khử trùng bề mặt bằng cách ngâm 15 phút trong cồn etanol 700, sau đó ngâm trong dung dịch Sodium hypochlorite 5% trong 30 phút, tiếp theo là rửa kỹ nhiều lần bằng nước cất vô trùng.
- Hạt đã vô trùng bề mặt được cấy vào đĩa thạch 0,5% agar (5 g/lít; thực hiện trong bốc cấy vô trùng), 5-7 hạt/đĩa, đậy kín parafin và úp ngược trong tủ ấm 270C và theo dõi nảy mầm trong thời gian 10 ngày.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Sau 7-10 ngày, hạt nảy mầm với đoạn rễ dài khoảng 3 - 5 cm, dùng panh và dao vô trùng cắt đoạn rễ (khoảng 3 - 4 đốt phân nhánh) và chuyển sang môi trường MS (Murashige and Skook 1962)có bổ sung IBA (Indole butylic acid) với nồng độ 1,5 ppm, cấy chuyển và lựa chọn được các dòng mô rễ Cà rốt và Medicago in vitro thuần, có sinh trưởng tốt nhất để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
b. Tạo vật liệu mô rễ chuyển gen Ri - tDNA
Tạo mô rễ invitro(Abdoulaye 2003, Chabaud et al. 2006):
Hình 2.2: Hạt Cà rốt nảy mầm sau 7 ngày gieo hạt (a) Nhân rễ Cà rốt (b)
- Hạt Cà rốt (Daucus carrota L.) được khử trùng bề mặt bằng cách ngâm 15 phút trong cồn etanol 700, sau đó ngâm 30 phút trong dung dịch Sodium hypochlorite 5%; tiếp theo là rửa kỹ nhiều lần bằng nước cất vô trùng.
- Hạt Cà rốt đã vô trùng bề mặt được cấy vào đĩa thạch 0,5% agar (5 g/lít; thực hiện trong bốc cấy vô trùng), đậy kín, parafin và úp ngược trong tủ ấm 270C và chờ nảy mầm trong 10 ngày.
- Sau khoảng 10 ngày, hạt nảy mầm với rễ trụ khoảng 1 cm, dùng panh và dao vô trùng cắt bỏ đầu rễ (khoảng 2 mm) và chuyển sang cấy nhiễm vi khuẩn
Agrobacterium rhizogenseschủng A4 bằng cách ngâm nhúng và phủ toàn bộ bề
mặt rễ trụ và vết cắt vào dung dịch vi khuẩn A. rhizogense với nồng độ tế bào 8 triệu cfu/ml.
Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn Agrobacterium rhizogensesChủng A4
(Abdoulaye 2003, Chabaud et al. 2006):
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Vi khuẩn Agrobacterium rhizogenses Chủng A4được duy trì nuôi cấy trên môi trườngTY/calcium [5g/l Bacto-tryptone, 3g/l Yeast extract, 6mM CaCl2 (được bổ sung sau khi hấp vô trùng); pH = 7,2; Agar 15g/l] . Sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trường TY/calcium, sinh khối khuẩn lạc A. rhizogenses được sử dụng cho cấy nhiễm mô rễ invitro với nồng độ tế bào là 8 triệu cfu/ml.
Cấy nhiễm, đồng nuôi cấy A. rhizogenses với mô rễ invitro và chuyển gen: - Sử dụng môi trường nuôi cấy mô rễ cấy nhiễm A. Rhizogenses là môi trường MS (Murashige and Skoog 1962) (đa lượng, vi lượng, vitamin, không chất kích thích sinh trưởng thực vật) 0,5% agar (Park et al. 2011).
- Hạt Cà rốt nảy mầm với rễ trụ đã cắt bỏ típ rễ được ngâm nhúng trong sinh khối khuẩn lạc A. rhizogenses (sau 48 giờ nuôi cấy) trong 5 - 7 phút, và được phủ 1 lớp vi khuẩn, sau đó được cấy chuyển vào môi trường trên nuôi cấy trong tủ ấm 250C trong 48 giờ (tối).
- Cấy chuyển sang môi trường MS mới (0,5% agar), bổ sung kháng sinh carbenicillin (500 mg/lít) để loại bỏ vi khuẩn A. rhizogenes và nuôi cấy phòng sinh trưởng 200
C, quang chu kỳ là 16 giờ trong 5 - 7 ngày.
- Theo dõi và chọn lựa giá thể mô rễ có sự hình thành phát triển lông rễ tốt sau khoảng 7 - 21 ngày.
Nuôi cấy trên môi trường chọn lọc có kháng sinh và tạo ―dòng thuần mô rễ
invitro có Ri-tDNA―:
- Sau 48 giờ đồng nuôi cấy với vi khuẩn A. rhizogenses, chủng A4 trong tủ ấm 250
C (tối), Các mô rễ Cà rốt được cấy chuyển sang môi trường MS mới (0,5% agar), bổ sung kháng sinh carbenicillin (500 mg/lít) để loại bỏ vi khuẩn A. rhizogenes còn lại và nuôi cấy phòng sinh trưởng 20 - 250C, quang chu kỳ là 16 giờ: đánh giá hiệu quả loại bỏ vi khuẩn A. rhizogensescủa kháng sinh carbenicillin bằng phân tích PCR (polymerase chain reaction) (Sidwa-Gorycka et al. 2009).
- Các mô rễ hình thành và phát triển lông rễ tốt nhất, phân nhánh và nhiều nhất (dấu hiệu hình thái là đã được chuyển gen Ri-tDNA từ vi khuẩn A.
rhizogenses) được chọn lọc, cắt và cấy chuyển sang môi trường MS mới (0,5%
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
rhizogenes và nuôi cấy phòng sinh trưởng 20 - 250C (tối) để tạo các ―dòng thuần
mô rễ Cà rốt invitro có Ri-tDNA― (cấy 1 mô rễ 3cm/đĩa petri) (Abdoulaye 2003, Sidwa-Gorycka et al. 2009).
- Các ―dòng thuần mô rễ invitro có Ri-tDNA― (không còn vi khuẩn A.
rhizogenes) sau đó được cấy chuyển trên môi trường MSR (0,5% agar), nuôi duy
trì trong phòng sinh trưởng hoặc tủ ấm 270
C và sử dụng làm giá thể cho nghiên cứu cộng sinh AM (Abuscular mycorrhizae) invitro(Declerck et al. 1998, Ijdo et al. 2011).
Kiểm tra mô rễ chuyển gen Ri-tDNA và hiệu quả loại bỏ vi khuẩn A.
rhizogensescủa kháng sinh carbenicillin bằng phân tích PCR (polymerase
chain reaction):
- Tách DNA từ mô rễ Cà rốt chuyển gen Ri-tDNA và rễ Cà rốt không chuyển gen Ri-tDNA (đối chứng) bằng kit tách chiết GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit (Fermentas), các bước thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất và có bổ sung 1% PVP vào Lysis Buffer.. DNA sau đó được điện di trên gen agarose 1% để kiểm tra chất lượng và được đo trên máy quang phổ NanoDrop ND1000 để kiểm tra độ tinh sạch của mẫu. Phản ứng PCR được thực hiện trên máy luân nhiệt C1000 Thermal Cycler (BioRad). Thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng PCR được thực hiện theo Krolicka et al. (2001). Tổng thể tích cho mỗi phản ứng là 20 l với thành phần bao gồm 10 l PCR Master Mix (Fermentas), 2 l mỗi mồi (10 pmol), 2 l của DNA (10 ng/l) và 6 l nước khử ion vô trùng. Chu trình nhiệt gồm: 940C - 3 phút, sau đó lặp lại 35 chu kỳ của 940C - 1 phút, 540C – 1 phút. 720C – 1 phút, cuối cùng là 720C – 10 phút và lưu ở 120C.
Sử dụng các mồi 5‗-GCTCTTGCAGTGCTAGATTT-3‗ và 5‗-
GAAGGTGCAAGCTACCTCTC-3‗ để phát hiện các gen rolB và 5‗-
CTCCTGACATCAAACTCGTC-3‗và 5‗-TGCTTCGAGTTATGGGTACA-3‗
trong phản ứng PCR để phát hiện các gen rolC của vi khuẩn A. rhizogenses (có trên đoạn T-DNA) trong bộ gen của mô rễ Cà rốt.
- Nhằm khẳng định các mô rễ Cà rốt chuyển gen Ri-tDNA hoàn toàn sạch vi khuẩn A. rhizogenes, phản ứng PCR được tiến hành với các mồi virG5‗-
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
ACTGAATATCAGGCAACGCC-3‗và5‗-CGTCAAAGAAATAGCCAGC 3‗
(Aoyama et al. 1989) để xác định có hay không các gen virG (gen nằm trên vòng Ri plasmid, ngoại trừ đoạn T-DNA) được chuyển sang mô rễ: Chu trình nhiệt gồm: 940C - 3 phút, sau đó lặp lại 35 chu kỳ của 940C - 1 phút, 540C – 1 phút. 720C – 1 phút, cuối cùng là 720C – 10 phút và lưu ở 120C