Trong phƣơng pháp này, ngƣời ta phân cực điện cực giọt thủy ngân bằng một điện áp một chiều biến thiên tuyến tính với thời gian để nghiên cứu các quá trình khử cực của chất phân tích trên điện cực đó. Vì vậy, thiết bị cực phổ gồm hai phần chính là máy cực phổ và hệ điện cực bao gồm điện cực giọt thuỷ ngân và điện cực so sánh. Đƣờng cực phổ biểu diễn sự phụ thuộc của chiều cao cƣờng độ dòng với nồng độ chất phân tích. Để xác định các lƣợng nhỏ chất thƣờng dùng cực phổ cổ điển. Để xác định các lƣợng chất cực nhỏ thƣờng dùng các phƣơng pháp cực phổ hiện đại nhƣ cực phổ sóng vuông, cực phổ xung vi phân [14].
Các tác giả Yongnian Ni, Ping Qiu, Serge Kokot (2004) [68], đã xác định 3 loại thuốc trừ sâu là methyl parathion (PTM), fenitrothion (FT) và parathion (PT) bằng phƣơng pháp cực phổ xung vi phân với một điện cực thả treo thủy ngân (HMDE). Các mẫu sau khi đƣợc xử lý sẽ đƣợc xác định bằng phƣơng pháp cực phổ với các điều kiện nhƣ sau: tốc độ quét 20mV/s, trong khoảng từ -10 mv đến - 1000mV, đỉnh pic của các chất lần lƣợt đối với Methyl parathion -458mV, fenitrothion -461mV và parathion -509mV. Khoảng tuyến tính của 3 loại OP trên từ 0,01 đến 0,12mg/l với độ lệch chuẩn tƣơng đối là 2,1; 1,8 và 1,9 cho lần lƣợt các chất. Giới hạn phát hiện lần lƣợt là 4,8; 4,5 và 4,5 đối với Methyl parathion, fenitrothion và parathion. Hiệu suất thu hồi nằm trong khoảng 75% đến 125%.
Các tác giả Guiberteau, Galeano Diáz, Salinas và J.M. Ortiz [29] đã xác định carbaryl và carbofuran bằng phƣơng pháp cực phổ xung vi phân. Phƣơng pháp đƣợc ứng dụng xác định các mẫu nƣớc sông. Các mẫu nƣớc sau khi xử lí sẽ đƣợc xác định bằng phƣơng pháp cực phổ xung vi phân với các điều kiện sau: tốc độ quét
26
20mV/s (bƣớc nhảy thế: 5mV, khoảng thời gian 0,25s), biên độ xung 50mV trong khoảng từ + 0,4V đến + 0,8V. Khoảng tuyến tính của carbaryl từ 5.10-7 đến 10-4M và của carbofuran từ 5.10-7 – 5.10-5M với độ lệch chuẩn tƣơng đối tƣơng ứng là 1,62 và 1,86%.
1.3.6. Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng là phƣơng pháp đơn giản, rẻ tiền, có thể tiến hành ở mọi phòng thí nghiệm, định tính và bán định lƣợng đƣợc hầu hết các loại hóa chất BVTV. Bản mỏng để phân tích thuốc BVTV làm bằng thủy tinh phẳng, kích thƣớc 20x20 cm hay 20x10 cm, đƣợc rải lớp huyền phù silicagel, oxit nhôm, than hoạt tính v.v … Sấy khô bản mỏng, chấm dịch chiết lên bản mỏng cách mép dƣới 1,5 cm. Đợi bay hết dung môi. Đặt thẳng đứng bản mỏng vào bình chứa dung môi, có chiều cao lớp dung môi 1cm. Đậy kín bình để phát triển dung môi. Khi dung môi lan lên cách mép trên bản mỏng 2cm, đƣa ra ngoài chờ bay hết dung môi. Phun lên bản mỏng thuốc thử để nhận biết chất cần phân tích. Dung môi chạy bản mỏng thƣờng là dung môi hữu cơ hay hỗn hợp dung môi hữu cơ. Lựa chọn hệ dung môi thích hợp để các hoạt chất có trong mẫu đƣợc tách ra khỏi nhau, đƣợc đặc trƣng bằng hệ số chạy Rf. Giá trị Rf là tỉ số chiều cao hoạt chất di chuyển đƣợc trên bản mỏng (tính từ tâm vết) so với chiều cao dung môi di chuyển, đặc trƣng cho sự tƣơng tác giữa hoạt chất - dung môi - chất hấp phụ. Thông qua giá trị Rf có thể định tính và qua diện tích vết để bán định lƣợng chất cần phân tích. Để có thể kết luận chính xác cần phải chạy 2 đến 3 hệ dung môi khác nhau.
Thuốc thử nhận biết các hóa chất BVTV nhóm clo hữu cơ là dung dịch bạc pha trong aceton. Sau đó soi bản mỏng dƣới ánh đèn tử ngoại, nhận biết các chất qua vết màu nâu đen.
Dung dịch p-Nitrobenzylpyridine, Tetraacetylenpentamine, Paladiclorua là những thuốc thử thông dụng đối với nhóm lân hữu cơ đƣợc phun lên bản mỏng sau khi oxi hóa chúng trong hơi benzen.
Có nhiều loại thuốc thử cho nhóm carbamat, những thuốc thử nhạy là: p- Dinitro diazonium fluoborate pha trong etanol. Sau khi chạy bản mỏng, phun lên
27
một lớp dung dịch KOH. Các chất carbamat bị thủy phân phản ứng với p-Dinitro diazonium fluoborate cho các hợp chất phức huỳnh quang màu hồng.
Ở nƣớc ta, phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng đã đƣợc áp dụng để phân tích BHC, Methyl parathion, Dimethoate trong gạo, đậu tƣơng, chè [19],[20],[24].
1.3.7. Xử lý mẫu (các kỹ thuật chiết, làm sạch và làm giàu hóa chất BVTV)
1.3.7.1. Chiết thông thường: a, Chiết lỏng - lỏng
Nguyên tắc: Sử dụng dung môi hữu cơ để chiết đối tƣợng phân tích tan trong
dung môi ở nhiệt độ thƣờng những mẫu đã làm nhỏ. Có thể dùng thêm một số tác nhân bổ trợ nhƣ: lắc cơ học, khuấy trộn siêu tốc, sóng siêu âm ….
Áp dụng và ưu nhược điểm: chiết lỏng - lỏng đƣợc sử dụng phổ biến để chiết
các hóa chất BVTV từ nông sản. Để chiết các hợp chất cơ phốt pho, cơ clo, trong các mẫu nông sản thƣờng dùng các loại dung môi ít phân cực nhƣ aceton, acetonitril, ethyl acetate … Kỹ thuật đơn giản, ít tốn kém. Tuy nhiên là sử dụng dung môi hữu cơ, ít nhiều ảnh hƣởng đến môi trƣờng và sức khỏe con ngƣời.
Tác giả Leoni (1991) [50] đã sử dụng acetonnitril để chiết 7 loại hóa chất bảo vệ thực vật cơ phốt pho trong rau quả. Sasaki (1987) trong báo cáo của mình đã sử dụng aceton và benzen để chiết các 23 loại OP trong mẫu rau quả. Blaha (1985) [31] cũng đã sử dụng aceton, methylen clohexan. Leoni (1992) [50] đã dùng aceton để chiết OP ra khỏi mẫu rau quả.
b, Chiết Soxhlet:
Nguyên tắc: dùng dung môi ở nhiệt độ cao sẽ chiết liên tục và chiết kiệt đối
tƣợng phân tích trong mẫu đã làm nhỏ. Thời gian chiết phụ thuộc bản chất mẫu.
Áp dụng và ưu, nhược điểm: một số tác giả đã sử dụng chiết Soxhlet để chiết hóa
chất BVTV trong nông sản [8], chè, dƣợc liệu [24]. Đây là kỹ thuật chiết kinh điển nhƣng khá hiệu quả. Nhƣợc điểm là thƣờng tốn dung môi hữu cơ và thời gian chiết dài.
28
Hình 1.4. Mô hình chiết Soxhlet
1.3.7.2. Chiết pha rắn (SPE) [12][25][48]
SPE là kỹ thuật xử lý mẫu dựa trên nguyên tắc sắc ký lỏng nhằm loại các ảnh hƣởng của nền mẫu hoặc làm giàu đối tƣợng phân tích trƣớc phân tích.
* Một số loại cột và pha tĩnh thƣờng dùng
Thân cột: thƣờng làm bằng thủy tinh hoặc chất dẻo tinh khiết chịu dung môi
(polypropylen), có dạng hình trụ (hình 1.4).
Pha tĩnh: pha tĩnh thƣờng dùng: C18, C8, C4, C2, Cyclohexan, Phenyl (Pha đảo); Silica, Florisil, Amino, Cyano, Diol, Alumina (Pha thƣờng); SAX (Trao đổi anion); SCX (Trao đổi catrion)
* Cơ chế chiết: tƣơng tự sắc ký lỏng - rắn
- Hấp phụ (pha thuận): sử dụng ngay các nhóm chức trên bề mặt nguyên liệu hấp phụ. Về cơ bản, sử dụng các điều kiện sắc ký pha thuận. Chất hấp phụ hay đƣợc dùng nhiều nhất là silicagel, magie silicat (Florisil), nhôm oxit.
- Phân bố trên pha liên kết (pha đảo): bề mặt chất hấp phụ đã thay đổi, đƣợc gắn thêm các nhóm chức hóa học khác nhau tạo ra cơ chế chiết theo kiểu sắc ký phân bố. Kiểu pha thuận: pha tĩnh phân cực giữ lại các chất phân tích phân cực, cho phép các chất phân tích không phân cực đi qua cột. Kiểu này thƣờng sử dụng các
29
dung môi ít hoặc không phân cực. Kiểu pha đảo: pha tĩnh không phân cực, kiểu này ngƣợc lại với kiểu trên, dung môi sử dụng thƣờng có độ phân cực nhất định.
- Trao đổi ion: bề mặt chất hấp phụ đƣợc gắn với các nhóm chức có thể ion hóa. Cơ chế tách chiết tƣơng tự sắc ký trao đổi ion.
Hình 1.5. Cơ chế SPE phân tích mẫu trong dung môi nƣớc
Hình 1.6. Cơ chế SPE phân tích mẫu trong dung môi khác nƣớc
30
Các bước thực hiện:
Hình 1.7. Các bƣớc thực hiện của phƣơng pháp SPE
Chọn cột chiết pha rắn: tùy thuộc kiểu chiết mô tả ở trên, thể tích mẫu, mức
độ tạp chất, mà chọn cột có thể tích, lƣợng và loại pha tĩnh khác nhau.
Luyện cột: cho dung môi đi qua chất hấp thu để thấm ƣớt và solvat hóa các
nhóm chức, đồng thời loại bỏ các khí trong cột và thay thế vào đó là dung môi.
Nạp mẫu vào cột chiết: chuyển mẫu lên cột, sau đó sử dụng áp suất giảm
hoặc để mẫu tự chảy.
Rửa loại tạp chất: đây là giai đoạn rửa giải cá tạp chất. Điều quan trọng nhất của quá trình này là chất phân tích không đƣợc tan trong dung dịch rửa.
Rửa giải chọn lọc lấy chất phân tích: dùng dung môi thích hợp để lấy chất
cần phân tích.
* Áp dụng và ưu nhược điểm: một số tác giả đã sử dụng kỹ thuật SPE để chiết
và làm sạch hóa chất BVTV trong rau quả. Ƣu điểm là lƣợng dung môi sử dụng thƣờng nhỏ (< 10 ml), thời gian chiết nhanh, tỷ lệ thu hồi cao, không tạo nhũ tƣơng, độ lặp lại tốt. Tuy nhiên cột SPE nhồi sẵn có giá thành tƣơng đối cao.
Các tác giả Fillion (2000) [37] đã sử dụng cột C18 và aminopropyl để làm sạch các thuốc trừ sâu dạng OP trong rau quả, hiệu suất thu hồi đạt 80% đến
31
125%. Cook (1990) [33] đã sử dụng cột C18 để làm sạch các OP trong mẫu nho, cam, xà lách, cà chua, hiệu suất thu hồi đạt 82% đến 112%. Alvin Chai L.K. và Lau Seng (2004) [27] đã sử dụng cột C18 để làm sạch các OP trong các mẫu rau cải, dƣa chuột và đậu xanh với hiệu suất thu hồi đạt 71% đến 107%.
1.3.7.3. Vi chiết pha rắn (SPME)
Nguyên tắc: SPME là quá trình chiết và tự làm giàu một cách chọn lọc chất
phân tích không phân cực từ mẫu lỏng phân cực lên pha tĩnh lỏng không phân cực phủ trên bề mặt sợi vi chiết. SPME là quá trình chiết đạt tới cân bằng tuân theo định luật phân bố, trong quá trình chiết thì mẫu luôn đƣợc khuấy trộn [24][39]
Thiết bị: Sợi làm bằng silica nung chảy phủ lớp pha tĩnh mỏng (carbowax,
PDMS), đặt trong lòng một chiếc kim gắn với một pít - tông làm bằng thép không gỉ. Tổ hợp này đƣợc đặt trong bộ phận bảo vệ (sy-ranh).
Hình 1.8. Mô hình phƣơng pháp SPME
Áp dụng và ưu nhược điểm: ban đầu SPME đƣợc áp dụng để chiết các chất cơ
clo trong môi trƣờng [53]. Gần đây SPME đã đƣợc áp dụng trong nhiều lĩnh vực nhƣ dƣợc phẩm, sinh học… Ƣu điểm của phƣơng pháp là rất nhạy, không sử dụng dung môi hữu cơ. Nhƣợc điểm là giá thành còn đắt, thời gian chiết kéo dài.
32
Các tác giả Magdic S., Pawliszyn J (1996) [53] đã xây dựng thành công phƣơng pháp vi chiết pha rắn để chiết 8 loại thuốc trừ sâu cơ clo ra khỏi nƣớc với khoảng nồng độ của các chất 0,001ng/ml đến 100ng/ml. Độ lặp lại của phƣơng pháp rất tốt với độ chính xác giữa các lần đo dƣới 20% RSD.
1.3.8. Phƣơng pháp phân tích định tính và định lƣợng [25]
a, Định tính:
Có thể dựa vào thời gian lƣu (tR), sử dụng các detecto có tính chọn lọc nhƣ ECD, NPD, FPD hay dùng detecto khối phổ để định tính các chất.
b, Định lượng:
* Chuẩn hóa diện tích: chuẩn hóa theo diện tích là cách tính theo tỷ lệ phần
trăm diện tích pic đƣợc coi tƣơng ứng với tỷ lệ phần trăm trọng lƣợng. Phƣơng pháp này không sử dụng trong phân tích dƣ lƣợng.
* Ngoại chuẩn: tiến hành sắc ký mẫu thử song song và đồng thời với dung
dịch chuẩn (chuẩn 1 điểm) hoặc dựng đƣờng chuẩn. Hàm lƣợng chất phân tích trong mẫu thử đƣợc xác định dựa vào đƣờng chuẩn.
* Nội chuẩn: phƣơng pháp này thƣờng đƣợc sử dụng khi độ lặp lại của hệ
thống không tốt hoặc hệ thống không đƣợc chuẩn hóa thƣờng xuyên. Sau khi tiến hành sắc ký, đƣờng chuẩn đƣợc xác định dựa vào tỷ số giữa diện tích pic các chất chuẩn và chất nội chuẩn, nhƣ vậy các sai số về thể tích đƣợc loại bỏ.
* Thêm chuẩn: chất chuẩn giống nhƣ chất cần phân tích đƣợc thêm vào mẫu
thử. Thêm chuẩn thƣờng nhằm hai mục đích: làm tăng độ nhạy của phƣơng pháp hoặc khảo sát độ đúng của phƣơng pháp.
33
Chƣơng 2
ĐỐI TƢỢNG P ƢƠNG TIỆN VÀ P ƢƠNG P P NG IÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu mục tiêu và nội dung nghiên cứu
2.1.1. Đối tƣợng và mục tiêu nghiên cứu
Hiện nay, nhiều ngƣời nông dân đã lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật làm cho dƣ lƣợng thuốc bảo vệ thực vật trong nhiều mẫu rau vƣợt giới hạn cho phép hàng chục lần; nhất là các loại rau ăn lá nhƣ: cải ngọt, mồng tơi, cải bẹ xanh, cải bắp, dƣa leo… Dƣ lƣợng hóa chất bảo vệ thực vật trong các loại rau quả quá cao đã gây ảnh hƣởng nghiêm trọng đến môi trƣờng và sức khỏe con ngƣời, là nguyên nhân chính gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm. Do đó, đối tƣợng nghiên cứu là một số loại rau nhƣ rau, củ, quả. Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu xây dựng phƣơng pháp xác định đồng thời dƣ lƣợng các thuốc trừ sâu cơ phốt pho trong rau, quả bằng phƣơng pháp sắc ký khí ghép nối khối phổ (GC/MS).
Trong luận văn này, chúng tôi sẽ tiến hành xác định các loại thuốc trừ sâu hữu cơ là Methyl parathion (Vofatox) và Parathion (Thiophot) là chính, bởi vì hai loại thuốc này vẫn đƣợc sử dụng khá phổ biến và có ảnh hƣởng rất lớn đến môi trƣờng cũng nhƣ sức khỏe con ngƣời.
2.1.2. Nội dung nghiên cứu
Để đạt đƣợc mục tiêu đề ra, cần nghiên cứu một cách có hệ thống các vấn đề sau:
2.1.2.1. Xây dựng phƣơng pháp
a) Khảo sát phƣơng pháp bao gồm: - Điều kiện chạy sắc ký GC/MS - Điều kiện tách chiết mẫu b)Thẩm định phƣơng pháp:
- Giới hạn phát hiện LOD, giới hạn định lƣợng LOQ - Khoảng tuyến tính
- Độ chụm (độ lặp lại)
34
2.1.2.2. Ứng dụng phƣơng pháp trong phân tích mẫu thật
Áp dụng phƣơng pháp mới xây dựng để xác định dƣ lƣợng thuốc bảo vệ thực vật cơ phốt pho trong một số loại rau và quả trên địa bàn Hà Nội.
2.2. Phƣơng tiện nghiên cứu 2.2.1. Thiết bị 2.2.1. Thiết bị
a, Máy SKK Agilent 6890 plus
b, Máy ly tâm Hettich 220 R
c, Dụng cụ SPE
Hình 2.1. Các thiết bị và dụng cụ cơ bản sử dụng trong nghiên cứu
Hệ thống sắc ký khí GC 6790 Plus và detector MS 5790 Agilent.
Máy lắc vortex.
Máy đồng nhất mẫu Ultra Turax T25.
Máy li tâm Hettich.
Cân phân tích (có độ chính xác 0,1mg và 0,01mg).
Cân kĩ thuật (có độ chính xác 0,01g).
Máy cất quay chân không Buchi.
Bộ chiết pha rắn
2.2.2. Dụng cụ
35
Ống li tâm 50ml
Cột chiết pha rắn C18 Bond Elute Agilent
Vial loại 1,8ml.
Pipet pasteur.
Ống đong, phễu, giấy lọc.
2.2.3. Dung môi hóa chất
Các loại hoá chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết của Merk.
Chuẩn OPs gồm: Thionazin, Sulfotep, Phorate, Disulfoton, Methyl parathion, Parathion của hãng Dr. Ehrenstorfer GmbH, Đức.
Methanol
n-hexan
Diclometan
Ete dầu hỏa
Toluen
Na2SO4
NaCl
Nƣớc cất 2 lần, deion.
2.3. Xây dựng các qui trình xử lý mẫu để phân tích các hóa chất BVTV 2.3.1. Phƣơng pháp lấy mẫu
Áp dụng TCVN 5139 : 2008 và tham khảo thêm quy định của Bộ Nông nghiệp & Phát triển nông thôn về phƣơng pháp lấy mẫu [3],[18].
Quá trình lấy mẫu dựa vào mục đích của quá trình phân tích để chọn phƣơng thức lẫy mẫu, vận chuyển và bảo quản, đảm bảo mẫu là đại diện. Quá trình phân tích trở nên không có ý nghĩa và khó lý giải nếu quá trình lấy mẫu không tuân thủ các nguyên tắc lấy mẫu hoặc sơ xuất trong quá trình lấy mẫu.
Ngƣời phân tích có thể lấy mẫu ngoài cánh đồng hoặc lấy mẫu lô hàng. Nếu lấy mẫu lô hàng thì mẫu phải đại diện cho một lô hàng. Mục đích của quá trình lấy
36
mẫu này là kiểm tra mức dƣ lƣợng hóa chất BVTV có vƣợt quá MRLs không. Trong quá trình lấy mẫu tránh làm nhiễm bẩn.
Mẫu lấy ngẫu nhiên ở các vị trí khác nhau. Mẫu đƣợc đựng trong túi PE sạch, mã hóa và mang về bảo quản trong tủ lạnh ở dƣới 5o