1.3.1. Phƣơng pháp sắc ký khí (GC)
Là kỹ thuật chia tách trong đó các thành phần của mẫu phân tích phân bố giữa hai pha: pha tĩnh với diện tích tiếp xúc rất lớn, pha động có bản chất khí thấm qua pha tĩnh. Các mẫu đƣợc làm bay hơi và đƣợc mang theo khí mang (pha động) đi qua cột. Mẫu đƣợc phân bố trên pha tĩnh lỏng dựa vào độ hòa tan ở nhiệt độ nhất định. Các thành phần của mẫu đƣợc phân tách ra khỏi nhau dựa trên áp suất hơi tƣơng đối và ái lực khác nhau của chúng đối với pha tĩnh [25],[38],[45]. Các loại detector sử dụng cho phƣơng pháp GC gồm có: TCD, NPD, ECD, FPD, MS…
Các tác giả Ligang Wang, Yongchao Liang, Xin Jiang [51] đã tiến hành xác định 8 loại thuốc trừ sâu nhóm phốt pho hữu cơ trong rau bằng phƣơng pháp sắc ký khí với detector NPD. Các chất OP đƣợc chiết ra khỏi mẫu bằng ethylacetat, ly tâm, lọc qua giấy lọc whatman; dịch lọc đƣợc cô quay để loại bớt dung môi đến 0,5ml rồi đem
20
đo. Giới hạn phát hiện đối với các chất OP trong khoảng 0,001 đến 0,005 µg/ml, hiệu suất thu hồi đạt từ 83% đến 125%.
Hình 1.1. Sơ đồ cấu tạo của một hệ thống sắc ký
Các tác giả Xiaozhong Hu, Yu Jianxin, Yan Zhigang, Ni Lansun, Zhang Yibin [66] đã tiến hành xác định đa dƣ lƣợng thuốc trừ sâu trong nƣớc táo bằng phƣơng pháp sắc ký khí khối phổ. Mẫu nƣớc táo đƣợc chiết bằng phƣơng pháp khuếch tán trên nền pha rắn diatomaceous (tảo cát) và rửa giải bằng dung môi hexan:diclometan = 1:1 tốc độ 5ml/phút. Phƣơng pháp có độ thu hồi 70 – 110% và hệ số biến thiên từ 1,62 – 18,3% với khoảng nồng độ 0,01 – 0,2mg/kg.
Các tác giả Conacher HB, Page BD, Lau BP, Lawrence JF, Bailey R, Calway P, Hanchay JP, Mori B [34] đã tiến hành xác định ethylcarbamat trong đồ uống bằng phƣơng pháp sắc ký khí với detector bắt điện tử và sắc ký khí khối phổ. Các mẫu đƣợc pha loãng bằng ethanol 10% rồi đƣợc chiết bằng diclometan. Dịch chiết đƣợc đem cô đến gần cạn và đem đo. Phƣơng pháp này đã đƣợc đánh giá ở 5 phòng thí nghiệm với 4 phòng sử dụng detector ECD và 1 phòng sử dụng detector MS. Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp thấp, khoảng 5µg/kg đối với detector ECD và 0,5µg/kg đối với detector MS.
Các tác giả Masuru Kawasaki, Tsuyoshi Inoue, Katsuharu Fukuhara, Sadao Uchiyama [54] đã tiến hành xác định thuốc trừ sâu carbamat trong thực phẩm bằng phƣơng pháp sắc ký khí khối phổ. Phƣơng pháp đã xác định đồng thời 29 loại thuốc trừ sâu trong một số thực phẩm nhƣ táo, khoai tây, gạo, chuối… Mẫu đƣợc chiết bằng aceton và đƣợc làm sạch bằng 3 loại cột chiết pha rắn khác nhau: cột
21
diatomaceous, cột diatomit kết hợp với cột C18, cột florisil. Hiệu suất chiết các mẫu thực phẩm bằng 3 loại cột đều trên 80%. Sau đó, mẫu đƣợc xác định bằng phƣơng pháp sắc ký khí khối phổ. Chƣơng trình chạy khối phổ đƣợc chia làm 7 cửa sổ thời gian lƣu và mỗi cửa sổ có từ 10 – 15 mảnh ion con. Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp thấp từ 0,01 – 0,1µg/ml.
1.3.2. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( PLC)
Phƣơng pháp này rất có hiệu quả trong việc tách các hợp chất có khối lƣợng phân tử trung bình. Trong phƣơng pháp này, pha tĩnh có độ phân cực lớn hơn pha động. Pha tĩnh bao gồm silicagel trần, silica biến tính phân cực cùng các chất hấp thụ rắn khác nhƣ oxit nhôm, magie silicat… Pha động là các dung môi phân cực trung bình, không phân cực, không nƣớc vì chúng có khả năng hòa tan tốt các chất phân tích. Các detecto kết hợp với HPLC bao gồm: detecto UV-VIS, huỳnh quang, điện hóa, mảng diot quang hoặc kết hợp với khối phổ [55].
Các tác giả Hans G.J.Mol, Ruud C.J. Van Dam, Odile M.Steijger [43] đã tiến hành xác định các hợp chất thuốc trừ sâu nhóm phốt pho phân cực bằng phƣơng pháp LC/MS/MS. Các chất cần phân tích đƣợc chiết với ethylacetat, ly tâm và đƣợc lọc qua màng PTFE rồi tiến hành xác định. Hiệu suất thu hồi đạt 80% đến 105% với RSD <11%. Giới hạn định lƣợng 0,01mg/kg và giới hạn phát hiện khoảng 0,001 đến 0,004mg/kg.
Tác giả Min Liu, Yuki hashi, Yuanyuan Song và Jin-Ming Lin [56],[57] đã tiến hành xác định đồng thời nhóm cacbamat và nhóm phốt pho hữu cơ trong rau quả bằng phƣơng pháp LC/MS. Các chất cần phân tích đƣợc chiết ra khỏi mẫu bằng acetonitril và làm sạch bằng chất hấp phụ PSA. Hiệu suất thu hồi nằm trong khoảng từ 80% đến 110% với RSD <8%. Giới hạn định lƣợng khoảng từ 0,5 đến 35µg/kg
Tác giả Elvira Grou và cộng sự [36] đã xác định thuốc bảo vệ thực vật carbamat trong đất và nƣớc bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng detector UV ở bƣớc sóng 254nm. Các mẫu nƣớc đƣợc chiết lỏng lỏng với diclometan, các mẫu đất đƣợc làm sạch bằng cột florisil. Dịch chiết đƣợc đem cô
22
quay đến cạn, hòa cặn bằng 1ml metanol và đem đo. Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp đối với mẫu nƣớc từ 0,005 – 0,01µg/g, đối với mẫu đất từ 0,05 - 0,1µg/g.
1.3.3. Phƣơng pháp điện di mao quản
Nguyên tắc: là dựa trên cơ sở tính chất điện di của các phần tử chất tan (các
ion chất tan, chất phân tích) trong mao quản (đƣờng kính 25 - 100 µm ID) trên nền của dung dịch chất điện giải và có chất đệm pH thích hợp, dƣới tác dụng của một từ trƣờng điện E nhất định đƣợc cung cấp bởi một nguồn thế cao một chiều (V: 15 - 40 kV) đặt vào hai đầu mao quản. Nghĩa là CEC là kỹ thuật tách đƣợc thực hiện trong mao quản nhờ lực từ trƣờng điện E điều khiển sự tách của các chất. Việc dùng cột mao quản có nhiều ƣu việt, nhƣ tốn ít mẫu và các hoá chất khác phục vụ cho sự tách, nhƣng số đĩa hiệu dụng Nef lớn, sự tách các chất xẩy ra nhanh và hiệu quả cao.
* Cơ chế điện di: Sự điện di của các phần tử chất tan (các ion) trong ống mao
quản là cơ chế di chuyển khác nhau của chất tan (chất phân tích), dƣới tác dụng của lực điện trƣờng E nhất định và tính chất của dòng điện di thẩm thấu (Electro- Osmotic Flow: EOF), trong sự phụ thuộc vào điện tích và kích thƣớc của chúng.
Kĩ thuật điện di mao quản là một kĩ thuật mới đƣợc phát triển khoảng hơn 10 năm trở lại đây. Đây là một kĩ thuật có thời gian phân tích nhanh, tốn ít dung môi và hóa chất. Việc xác định các hóa chất bảo vệ thực vật bằng thiết bị này vẫn đang đƣợc nghiên cứu và chƣa có nhiều loại thuốc trừ sâu đƣợc xác định bằng phƣơng pháp này.
Các tác giả Gordon Ross, Monika Dittmann Agilent Technologies, Waldbronn, Germany, Thomas Adam thuộc đại học Mainz, Đức [40] đã tiến hành xác định các herbicides bằng phƣơng pháp CEC. Thiết bị sử dụng của hãng Agilent kết hợp với detecto mảng diot. Các dung dịch đệm đƣợc lọc và làm khô trƣớc khi sử dụng. Hình 1.1 mô tả cho quá trình tách của các loại thuốc diệt cỏ.
23
Hình 1.2. Sắc đồ của một số loại thuốc diệt cỏ tách bằng CE
Các tác giả Gordon Ross, Kaho Minoura [41] đã tiến hành xác định các chất diệt cỏ trên thiết bị CE/MS. Kết quả cho thấy thiết bị tách nhanh và chính xác các loại thuốc diệt cỏ (hình 1.2). Khảo nghiệm có khả năng tái cho. Độ lặp lại rất tốt đối thời gian lƣu là 0,14 đến 0,16% RSD và đối với diện tích pic là 4,2% đến 4,5% RSD. Khoảng tuyến tính từ 0 đến 10mg/ml với r2 là 0,99928.
Tác giả Xiaoping Wu và cộng sự [65] đã tách và xác định dƣ lƣợng thuốc trừ sâu carbamat bằng phƣơng pháp điện di mao quản đẳng áp. Cột mao quản có đƣờng kính 75µm đƣợc nhồi hạt ODS 3µm. Pha động bao gồm 30% acetonitril và 70% dung dịch đệm CH3COONH4 5mM (pH = 6,5) chứa 1mM SDS và 0,01% trietylamine (TEA). Tại các điều kiện tối ƣu, 10 carbamat đã đƣợc tách nhanh trong vòng 20 phút. Các mẫu rau đƣợc làm sạch qua SPE. Phƣơng pháp có giới hạn phát hiện từ 0,05 - 1,6mg/kg và hiệu suất thu hồi từ 51,3 - 109,2% với độ lệch chuẩn RSD < 11,4%. Phƣơng pháp đã đƣợc áp dụng để xác định 10 loại carbamat trong một số loại rau.
Các tác giả Yugui Tao, Yaoming Wang, Lianbin Ye, Hefei Li, Qiang Wang (2008) [67] đã sử dụng phƣơng pháp điện di mao quản và phƣơng pháp tối ƣu hóa mặt mục tiêu để phát hiện đồng thời của omethoate và dichlorvos. Kết quả cho thấy các điều kiện tối ƣu cho omethoate và xác định dichlorvos là: pH 7,64; nồng độ SDS 67,5mM, tách điện áp 19,0 KV.
Khoảng tuyến tính định lƣợng 1,0-300 ng/mL omethoate và dichlorvos với hệ số tƣơng quan tƣơng ứng là 0,9967 và 0,9965. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
24
Hình 1.3. Sắc đồ của Omethoat và Dichlovos
Các giới hạn phát hiện là 0,046 ng/mL và 0,031ng/mL cho omethoate và dichlorvos, với độ lệch tiêu chuẩn tƣơng đối 3,6% (RSD). Hiệu suất thu hồi của omethoate và dichlorvos từ 94,1% đến 106,0% (Bảng 1.2).
Bảng 1.2. Hiệu suất thu hồi của Omethoate và Dichlorvos
1.3.4. Phƣơng pháp phổ UV-VIS
Phƣơng pháp phổ UV-VIS là một trong những phƣơng pháp chính để xác định dƣ lƣợng thuốc trừ sâu. Tuy nhiên phƣơng pháp này đã không còn đƣợc sử dụng nhiều trong những năm gần đây. Phƣơng pháp này dựa trên nguyên tắc sự hấp thụ của các chất. Việc sử dụng phƣơng pháp phổ UV-VIS để xác định dƣ lƣợng thuốc BVTV bị giới hạn bởi độ nhạy và độ chọn lọc thấp.
Tác giả Turner [63] đã sử dụng 4-(4-nitro-benzyl)-pyridine để làm thuốc thử cho hầu hết các loại thuốc trừ sâu. Tuy nhiên độ nhạy của phƣơng pháp thấp cỡ microgam.
Các tác giả Sunitha B. Mathew, Ajai K. Pillai, Vinay K [60] đã dùng phƣơng pháp phổ UV-VIS để xác định các thuốc trừ sâu loại OP nhƣ malthion,
25
dimethoate và phorate. Nguyên tắc của phƣơng pháp dựa trên quá trình oxy hóa của thuốc trừ sâu nhóm OP với sự có mặt dƣ của N-bromosuccinimide (NBS) và đƣợc xác định với Rhodamine B (max: 550nm). Khoảng nồng độ của các chất tuân theo định luật Beer lần lƣợt là phorate (0,108-1,08)g/ml; malathion (0,056-0,56)g/ml; Dimethoate (0,028-0,28)g/ml với độ lệch chuẩn <2% (RSD) . Phƣơng pháp này đạt đƣợc hiệu suất thu hồi rất tốt từ 94% đến 96%.
1.3.5. Phƣơng pháp cực phổ
Trong phƣơng pháp này, ngƣời ta phân cực điện cực giọt thủy ngân bằng một điện áp một chiều biến thiên tuyến tính với thời gian để nghiên cứu các quá trình khử cực của chất phân tích trên điện cực đó. Vì vậy, thiết bị cực phổ gồm hai phần chính là máy cực phổ và hệ điện cực bao gồm điện cực giọt thuỷ ngân và điện cực so sánh. Đƣờng cực phổ biểu diễn sự phụ thuộc của chiều cao cƣờng độ dòng với nồng độ chất phân tích. Để xác định các lƣợng nhỏ chất thƣờng dùng cực phổ cổ điển. Để xác định các lƣợng chất cực nhỏ thƣờng dùng các phƣơng pháp cực phổ hiện đại nhƣ cực phổ sóng vuông, cực phổ xung vi phân [14].
Các tác giả Yongnian Ni, Ping Qiu, Serge Kokot (2004) [68], đã xác định 3 loại thuốc trừ sâu là methyl parathion (PTM), fenitrothion (FT) và parathion (PT) bằng phƣơng pháp cực phổ xung vi phân với một điện cực thả treo thủy ngân (HMDE). Các mẫu sau khi đƣợc xử lý sẽ đƣợc xác định bằng phƣơng pháp cực phổ với các điều kiện nhƣ sau: tốc độ quét 20mV/s, trong khoảng từ -10 mv đến - 1000mV, đỉnh pic của các chất lần lƣợt đối với Methyl parathion -458mV, fenitrothion -461mV và parathion -509mV. Khoảng tuyến tính của 3 loại OP trên từ 0,01 đến 0,12mg/l với độ lệch chuẩn tƣơng đối là 2,1; 1,8 và 1,9 cho lần lƣợt các chất. Giới hạn phát hiện lần lƣợt là 4,8; 4,5 và 4,5 đối với Methyl parathion, fenitrothion và parathion. Hiệu suất thu hồi nằm trong khoảng 75% đến 125%.
Các tác giả Guiberteau, Galeano Diáz, Salinas và J.M. Ortiz [29] đã xác định carbaryl và carbofuran bằng phƣơng pháp cực phổ xung vi phân. Phƣơng pháp đƣợc ứng dụng xác định các mẫu nƣớc sông. Các mẫu nƣớc sau khi xử lí sẽ đƣợc xác định bằng phƣơng pháp cực phổ xung vi phân với các điều kiện sau: tốc độ quét
26
20mV/s (bƣớc nhảy thế: 5mV, khoảng thời gian 0,25s), biên độ xung 50mV trong khoảng từ + 0,4V đến + 0,8V. Khoảng tuyến tính của carbaryl từ 5.10-7 đến 10-4M và của carbofuran từ 5.10-7 – 5.10-5M với độ lệch chuẩn tƣơng đối tƣơng ứng là 1,62 và 1,86%.
1.3.6. Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng là phƣơng pháp đơn giản, rẻ tiền, có thể tiến hành ở mọi phòng thí nghiệm, định tính và bán định lƣợng đƣợc hầu hết các loại hóa chất BVTV. Bản mỏng để phân tích thuốc BVTV làm bằng thủy tinh phẳng, kích thƣớc 20x20 cm hay 20x10 cm, đƣợc rải lớp huyền phù silicagel, oxit nhôm, than hoạt tính v.v … Sấy khô bản mỏng, chấm dịch chiết lên bản mỏng cách mép dƣới 1,5 cm. Đợi bay hết dung môi. Đặt thẳng đứng bản mỏng vào bình chứa dung môi, có chiều cao lớp dung môi 1cm. Đậy kín bình để phát triển dung môi. Khi dung môi lan lên cách mép trên bản mỏng 2cm, đƣa ra ngoài chờ bay hết dung môi. Phun lên bản mỏng thuốc thử để nhận biết chất cần phân tích. Dung môi chạy bản mỏng thƣờng là dung môi hữu cơ hay hỗn hợp dung môi hữu cơ. Lựa chọn hệ dung môi thích hợp để các hoạt chất có trong mẫu đƣợc tách ra khỏi nhau, đƣợc đặc trƣng bằng hệ số chạy Rf. Giá trị Rf là tỉ số chiều cao hoạt chất di chuyển đƣợc trên bản mỏng (tính từ tâm vết) so với chiều cao dung môi di chuyển, đặc trƣng cho sự tƣơng tác giữa hoạt chất - dung môi - chất hấp phụ. Thông qua giá trị Rf có thể định tính và qua diện tích vết để bán định lƣợng chất cần phân tích. Để có thể kết luận chính xác cần phải chạy 2 đến 3 hệ dung môi khác nhau.
Thuốc thử nhận biết các hóa chất BVTV nhóm clo hữu cơ là dung dịch bạc pha trong aceton. Sau đó soi bản mỏng dƣới ánh đèn tử ngoại, nhận biết các chất qua vết màu nâu đen.
Dung dịch p-Nitrobenzylpyridine, Tetraacetylenpentamine, Paladiclorua là những thuốc thử thông dụng đối với nhóm lân hữu cơ đƣợc phun lên bản mỏng sau khi oxi hóa chúng trong hơi benzen.
Có nhiều loại thuốc thử cho nhóm carbamat, những thuốc thử nhạy là: p- Dinitro diazonium fluoborate pha trong etanol. Sau khi chạy bản mỏng, phun lên
27
một lớp dung dịch KOH. Các chất carbamat bị thủy phân phản ứng với p-Dinitro diazonium fluoborate cho các hợp chất phức huỳnh quang màu hồng.
Ở nƣớc ta, phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng đã đƣợc áp dụng để phân tích BHC, Methyl parathion, Dimethoate trong gạo, đậu tƣơng, chè [19],[20],[24].
1.3.7. Xử lý mẫu (các kỹ thuật chiết, làm sạch và làm giàu hóa chất BVTV)
1.3.7.1. Chiết thông thường: a, Chiết lỏng - lỏng
Nguyên tắc: Sử dụng dung môi hữu cơ để chiết đối tƣợng phân tích tan trong
dung môi ở nhiệt độ thƣờng những mẫu đã làm nhỏ. Có thể dùng thêm một số tác nhân bổ trợ nhƣ: lắc cơ học, khuấy trộn siêu tốc, sóng siêu âm ….
Áp dụng và ưu nhược điểm: chiết lỏng - lỏng đƣợc sử dụng phổ biến để chiết
các hóa chất BVTV từ nông sản. Để chiết các hợp chất cơ phốt pho, cơ clo, trong các mẫu nông sản thƣờng dùng các loại dung môi ít phân cực nhƣ aceton, acetonitril, ethyl acetate … Kỹ thuật đơn giản, ít tốn kém. Tuy nhiên là sử dụng dung môi hữu cơ, ít nhiều ảnh hƣởng đến môi trƣờng và sức khỏe con ngƣời. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tác giả Leoni (1991) [50] đã sử dụng acetonnitril để chiết 7 loại hóa chất bảo vệ thực vật cơ phốt pho trong rau quả. Sasaki (1987) trong báo cáo của mình đã sử dụng aceton và benzen để chiết các 23 loại OP trong mẫu rau quả. Blaha (1985) [31] cũng đã sử dụng aceton, methylen clohexan. Leoni (1992) [50] đã dùng aceton để chiết OP ra khỏi mẫu rau quả.
b, Chiết Soxhlet:
Nguyên tắc: dùng dung môi ở nhiệt độ cao sẽ chiết liên tục và chiết kiệt đối
tƣợng phân tích trong mẫu đã làm nhỏ. Thời gian chiết phụ thuộc bản chất mẫu.
Áp dụng và ưu, nhược điểm: một số tác giả đã sử dụng chiết Soxhlet để chiết hóa