SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

1.4.1. Khái niệm

Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phƣơng pháp sắc ký cột cổ điển. HPLC là một phƣơng pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã đƣợc phân chia dƣới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã đƣợc biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ. Phƣơng pháp này ngày càng đƣợc sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lƣợng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt.

Phạm vi ứng dụng của phƣơng pháp HPLC rất rộng , nhƣ phân tích các hợp chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnh vực thực phẩm, dƣợc phẩm, môi trƣờng…

1.4.2. Phân loại

Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, ngƣời ta chia HPLC thành 4 loại:

 Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption/liquid chromatography).  Sắc ký phân bố (partition chromatography).

 Sắc ký ion (ion chromatography).

 Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography).

Riêng SKPB đƣợc chia thành hai loại dựa trên độ phân cực tƣơng đối giữa pha tĩnh và pha động: sắc ký pha thƣờng – SKPT (normal phase chromatography) và sắc ký pha đảo – SKPĐ (reversed phase chromatography).

Trong đó, sắc ký pha đảođƣợc sử dụng nhiều hơn cả.

1.4.3. Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo

Trong sắc ký phân bố nói chung, pha tĩnh là những hợp chất hữu cơ đƣợc gắn lên chất mang rắn silica hoặc cấu thành từ silica theo hai kiểu:

 Pha tĩnh đƣợc giữ lại trên chất mang rắn bằng cơ chế hấp phụ vật lý → sắc ký lỏng-lỏng (liquid-liquid chromatography).

18

 Pha tĩnh liên kết hóa học với chất nền → sắc ký pha liên kết (bonded phase chromatography)

Trong quá trình sử dụng, ngƣời ta nhận thấy sắc ký pha liên kết có nhiều ƣu điểm hơn sắc ký pha lỏng-lỏng vì một số nguyên nhân sau:

o Pha tĩnh trong hệ sắc ký lỏng-lỏng dễ bị hòa tan bởi pha động nên dễ bị mất mát pha tĩnh trong thời gian sử dụng và gây nhiễm đối với hợp chất phân tích.

o Do pha tĩnh của sắc ký lỏng-lỏng dễ tan trong pha động nên ngƣời ta không thể ứng dụng phƣơng pháp rửa giải gradient dung môi. Vì vậy, ngƣời ta thƣờng chỉ quan tâm đến loại sắc ký phân bố pha liên kết và phần lớn các loại cột sử dụng hiện nay trong sắc ký phân bố đều có cấu trúc dạng này.

Trong SKPĐ, nhóm thế R trong hợp chất siloxan hầu nhƣ không phân cực hoặc ít phân cực. Đó là các ankyl mạch dài nhƣ C8 (n-octyl), C18 (n-octadecyl) còn gọi là ODS (octadecylsilan) hoặc các nhóm alkyl ngắn hơn nhƣ C2; ngoài ra còn có cyclohexyl, phenyl trong đó nhóm phenyl có độ phân cực cao hơn nhóm alkyl. Ngƣời ta nhận thấy các alkyl mạch dài cho kết quả tách ổn định hơn các loại khác nên đây là loại đƣợc sử dụng nhiều nhất.

Hình 1.9. Cấu trúc của cột ODS

1.4.4. Pha động trong sắc ký pha đảo

Pha động trong sắc ký lỏng nói chung phải đạt những yêu cầu sau:  Hòa tan mẫu phân tích.

 Phù hợp với đầu dò.

 Không hòa tan hay làm mòn pha tĩnh.

 Có độ nhớt thấp để tránh áp suất dội lại cao.  Tinh khiết dùng cho sắc ký.

19

Trong sắc ký pha đảo , dung môi pha động có độ phân cực cao. Trên lý thuyết chúng ta có thể sử dụng khá nhiều dung môi nhƣng kinh nghiệm thực tế cho thấy nƣớc, methanol, acetonitrile, tetrahydrofuran là đạt yêu cầu nhất. Trong đó nƣớc là một dung môi đƣợc cho vào các dung môi hữu cơ để giảm khả năng rửa giải.

Trong quá trình tách của SKPĐ, sự tƣơng tác giữa hợp chất cần phân tích và pha động phụ thuộc rất nhiều vào moment lƣỡng cực, tính acid hoặc tính base của dung môi. Do đó độ phân cực và độ rửa giải của dung môi có tác động lớn lên khả năng phân tách của sắc ký.

Thông thƣờng pha động trong SKPĐ bao gồm một hỗn hợp nƣớc hoặc dung dịch đệm với một hoặc nhiều dung môi hữu cơ phân cực tan đƣợc trong nƣớc.

Thành phần pha động có thể cố định trong suốt quá trình chạy sắc ký (chế độ isocratic) hoặc đƣợc thay đổi theo một chƣơng trình đã định sẵn (chƣơng trình gradien dung môi) để có hiệu quả tách tốt hơn.

1.4.5. DETECTOR DAD

Trung tâm của thiết bị là một dãy diot hàng trăm chiếc (những máy hiện nay có thể lắp 1024 diot) đƣợc sắp xếp cạnh nhau liên tục thành dãy trên tấm silicon tinh khiết, kích thƣớc 1-6 cm, độ rộng của mỗi diot riêng là 0,0015 – 0,050 mm.

Hình 1.10. Sơ đồ nguyên lý hệ điot quang

Trên mỗi tấm silicon còn có một tụ điện, một công tắc cho mỗi diot. Hệ thống đƣợc điều khiển bằng computer luôn ngắt mỗi công tắc làm cho tụ điện đƣợc tích – 5V. Khi bức xạ chiếu vào mặt diot làm đóng mạch điện và tụ điện phóng điện. Sự nạp điện lại đƣợc tiếp tục ở chu kỳ tiếp theo. Kết quả là dòng điện tỷ lệ với lƣợng bức xạ chiếu vào, khuếch đại, số hóa và ghi lại vào bộ nhớ.

20

a) đường quang chữ Z, b) đường quang bong bóng, c) đường quang phản xạ nhiều lần

Hình 1.11. Các biện pháp cải tiến tăng độ nhạy của detector (cải tiến flowcell).

1.4.6. DETECTOR MS

Phƣơng pháp khối phổ (Mass Spectrometry-MS) là phƣơng pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lƣợng phân tử của chất đó dựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong điện trƣờng hoặc từ trƣờng nhất định. Tỉ số giữa khối lƣợng và điện tích (m/z) có ảnh hƣởng rất lớn đối với chuyển động này của ion. Nếu biết đƣợc điện tích của ion thì ta dễ dàng xác định đƣợc khối lƣợng của ion đó.

Do quá trình phân tích với đầu dò MS đòi hỏi mƣ́c đô ̣ chân không cao , nhiê ̣t đô ̣ cao , các chất khảo sát phải ở trạng thái khí , vâ ̣n tốc dòng chảy nhỏ ; trong khi hê ̣ thống LC la ̣i hoa ̣t đô ̣ng ở áp suất cao vớ i mô ̣t lƣợng dung môi tƣơng đối lớn, nhiê ̣t đô ̣ tƣơng đối thấp , các chất phân tích ở thể lỏng . Điều này gây rất nhiều khó khăn trong viê ̣c tìm cách giải quyết đƣợc sƣ̣ tƣơng thích giƣ̃a hê ̣ thống sắc ký lỏng và đầu dò khối phổ.

Để khắc phu ̣c nhƣ̃ng khó khăn trên , cần phải có mô ̣t kỹ thuâ ̣t trung gian gọi là giao diê ̣n . Rất nhiều kỹ thuâ ̣t giao diê ̣n (interface technology) nhƣ chùm tia ha ̣t (FB), bắn phá nguyên tƣ̉ nhanh dòng liên tu ̣c (CF-FAB),… đã đƣợc nghiên cƣ́u và ƣ́ng du ̣ng , nhƣng mãi cho đến cuối thâ ̣p nhiên 80, mới có sƣ̣ đô ̣t phá thật sự với kỹ thuật ion hóa tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Ionization – API).

Ƣu điểm nổi bật của API là khả năng hình thành ion tại áp suất khí quyển ngay trong buồng ion hóa. Điều này khác biệt với các kiểu ion hóa sử dụng trƣớc đó cho LC/MS nhƣ bắn phá nguyên tử nhanh với dòng liên tục (continuous flow- fast atom bombardment CF-FAB) hay nhƣ tia nhiệt (thermospray – TS) đều đòi hỏi áp suất thấp . Một thuận lợi nữa của API là sự ion hóa mềm (soft ionization), không phá vỡ cấu trúc của hợp chất cần phân tích

21

nhờ đó thu đƣợc khối phổ của ion phân tử . Ngoài ra, với kỹ thuật này, ngƣời ta có thể điều khiển đƣợc quá trình phá vỡ ion phân tử để tạo ra những ion con tùy theo yêu cầu phân tích.

Có ba kiểu hình thành ion ứng dụng cho nguồn API trong LC/MS: * Phun mù điện tử (ESI).

* Ion hóa hóa học tại áp suất khí quyển (APCI). * Ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (APPI).

Trong đó, hai kỹ thuật APCI và ESI , đă ̣c biê ̣t là ESI đƣợc sử dụng nhiều hơn cả.

c. Các loại đầu dò khối phổ

Có các loại tổng quát sau:

* Sự uấn cong nhờ từ trƣờng (Magnetic field deflection)

- Máy khối phổ đơn giản sử dụng từ trƣờng (a single focussing magnetic sector mass spectrometer): máy có độ phân giải thấp.

- Máy khối phổ nhị tiêu (double focussing mass spectrometer): sự uốn cong nhờ từ trƣờng và điện trƣờng, máy có độ phân giải cao.

* Máy khối phổ tứ cực (quadrupole mass spectrometer) - Máy khối phổ tứ cực (quadrupole mass filter) - Bẫy ion (quadrupole ion storage; ion trap)

* Máy khối phổ sử dụng kỹ thuật thời gian bay (time of flight mass spectrometry)

* Máy khối phổ cộng hƣởng cyclotron-ion, sử dụng phép biến đổi Fourier (Fourier transform-ion cyclotron resonance mass spectrometry: FTMS).

Trong đó, Máy khối phổ tứ cực; máy khối phổ sử dụng kỹ thuật thời gian bay; máy khối phổ cộng hƣởng cyclotron-ion, sử dụng phép biến đổi Fourierđƣợc sử dụng nhiều hơn cả

22

CHƢƠNG 2. THỰC NGHIỆM 2.1. Phƣơng pháp nghiên cứu và trang thiết bị.

2.1.1. Các phƣơng pháp tổng hợp hữu cơ.

Sử dụng phản ứng đóng vòng Staudinger và một số phƣơng pháp khác tại phòng thí nghiệm Hoá dƣợc- Viện Hoá học- Viện Khoa học & Công nghệ Việt Nam.

2.1.2. Dụng cụ và hóa chất.

Nguyên liê ̣u đ ầu: phenol, m-clophenol, este 2-brom metylaxetat, benzylamin, p-brom benzandehit….

Dung môi: axeton, metanol, etanol, n-hexan, diclometan, etyl axetat, nƣớc.

Dung dịch hiện màu: dragendoff, ceri sunfat/ axit sunfuric đặc.

Các chất xúc tác và dung môi khác cho các phản ứng đƣợc mua của hãng Merck (Đức) và Aldrich (Mỹ).

Bột silica gel cho sắc kí cột kích thƣớc 0,01÷0,02 mm (Merck), bông y tế dùng nhồi cột.

Bản mỏng sắc kí silica gel đế nhôm tráng sẵn Art. 5554 DC – Alufolien Kiesel 60 F254 , dày 0,2 mm, kích thƣớc 20 x 20 cm (Merck).

Cột sắc kí thuỷ tinh, giá ống nghiệm, ống capila, bình triển khai sắc kí bản mỏng.

Bình cầu phản ứng 250 ml, con khuấy từ, máy khuấy từ, giá kẹp bình phản ứng.

23

2.1.3. Định tính phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của dẫn xuất bằng sắc kí lớp mỏng. kí lớp mỏng.

Sắc kí lớp mỏng (SKLM) đƣợc sử dụng để định tính chất đầu và sản phẩm. Thông thƣờng chất đầu và sản phẩm với giá trị Rf khác nhau, màu sắc và sự phát quang khác nhau…. Dùng sắc kí lớp mỏng để biết đƣợc phản ứng xảy ra, không xảy ra, kết thúc phản ứng… dựa vào các vết trên bản mỏng, cùng các giá trị Rf tƣơng ứng. Giá trị Rf của các chất phụ thuộc vào bản chất và phụ thuộc vào dung môi làm pha động. Dựa trên tính chất đó, chúng ta có thể tìm đƣợc dung môi hay hỗn hợp dung môi để các chất tách ra xa khỏi nhau (Rf khác xa nhau) hay tìm đƣợc hệ dung môi cần thiết để tinh chế các chất.

Quy trình chạy sắc kí lớp mỏng:

Cho chất lên bản sắc kí: Hòa tan hoàn toàn chất nghiên cứu bằng dung môi dùng để điều chiết sao cho dung dịch thu đƣợc không quá loãng hay quá đặc. Dùng capila thủy tinh lấy chất rồi chấm lên trên bản mỏng sao cho các vệt chấm phải tròn, gọn và các mép bên của bản mỏng 0,5 cm; cách chân bản mỏng 0,7 cm. Các vết chất cách nhau 0,5 cm. Chiều cao bản mỏng 7 cm.

Tiến hành sắc kí lớp mỏng:

Pha hệ dung môi với tỷ lệ thích hợp cho vào bình sắc kí có nút nhám và lắc kỹ. Đặt một mảnh giấy lọc vào thành bình để bão hòa dung môi. Lƣợng dung môi lấy sao cho khi triển khai SKLM không để cho dung môi ngập vết chất.

Cho bản mỏng đã chấm vào bình sắc kí, bản mỏng đƣợc đặt nghiêng một góc 15. Bình sắc kí phải để yên trong suốt quá trình triển khai. Khi tiền tuyến dung môi cách mép trên 0,3 cm thì lấy bản mỏng ra. Làm khô bản mỏng, sau đó hiện sắc phổ dƣới đèn tử ngoại rồi bằng thuốc hiện.

2.1.4. Các phƣơng pháp phân tích cấu trúc.

Để xác định cấu trúc các chất hữu cơ tổng hợp đƣợc, chúng tôi tiến hành các phƣơng pháp sau:

24

- Xác định nhiệt độ nóng chảy

Nhiệt độ nóng chảy của các chất tổng hợp đƣợc đo trên máy Gallenkamp của Anh tại phòng thí nghiệm Tổng hợp hữu cơ - Viện Hoá học - Viện Khoa học & Công nghệ Việt Nam.

- Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR)

Phổ 1H-NMR (500MHz) và 13C-NMR (125MHz) của các chất nghiên cứu đƣợc đo trên máy Bruker XL-500 tần số 500 MHz với dung môi CDCl3 và TMS là chất chuẩn, tại phòng Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân - Viện Hoá Học - Viện Khoa học & Công nghệ Việt Nam.

- MÁY HPLC

+ Hóa chất, thiết bị dùng cho máy HPLC

Dung môi: Kênh A: H2O (PA); Kênh B: Metanol (PA)

Pha tĩnh: Cột thép không gỉ (25 cm x 4,6 mm) đƣợc nhồi octadecylsilayl silica gel (C18)

Thiết bị:LC-MSD Agilent 1100 Series (USA)

+ Đặt điều kiện cho hệ thống

Detector DAD: đặt ở bƣớc sóng 260nm. Detector MS:

- Source: ESI

- Capilary: 3000V; 17nA

- End Plate Offset: 500V; 435nA

- Dry Gas: 5,0 l/min - Dry Temp: 325 ºC - Skimmer: 40.0V

- Cap Exit: 200.0V - Polarity: Positive Flow: 0,25 ml/min

25

Thể tích tiêm: 20 – 50 µl (tùy vào lƣợng mẫu)

Min

Gradient pha động

Gradient 1 Gradient 2 Gradient 3

%B %B %B 0 5 6 10 15 16 17 30 5 20 20 50 70 100 100 100 15 30 30 50 100 100 100 100 20 30 60 80 100 100 100 100 2.2. Tổng hợp các hợp chất β-lactam

2.2.1. Tổng hợp dẫn xuất 2-phenoxy clorua axetic

Hỗn hợp của phenol (5,1 mmol) 1a, DMF (3 ml) và Na2CO3 (5,1 mmol) đƣợc đun hồi lƣu ở 140o

C, trong thời gian 10 phút. Sau đó thêm este 2-brom metyl axetat (4,6 mmol) và tiếp tục đun hồi lƣu ở 140oC, trong khoảng 4h. Hỗn hợp sau phản ứng đƣợc cho thêm dung dịch HCl 10% đến môi trƣờng axit, sau đó thêm dung dịch NaHCO3 đến môi trƣờng trung tính và đƣợc chiết ba lần bằng CH2Cl2. Dịch chiết CH2Cl2 đƣợc làm khô bằng Na2SO4 và loại bỏ dung môi ở áp suất thấp thu đƣợc sản phẩm thô 2a, sau đó thêm 8 ml NaOH 1N và 8 ml MeOH/H2O (1:1), tiếp tục đun hồi lƣu ở 140o

C trong 24h. Hỗn hợp sau phản ứng đƣợc chiết bằng CH2Cl2, dịch chiết đƣợc làm khô bằng Na2SO4 và loại bỏ dung môi ở áp suất thấp thu đƣợc sản phẩm thô . Sản phẩm thô đƣợc làm sạch bằng sắc ký cột với hệ dung môi rƣ̉ a giải là n-hexan/EtOAc (9:1) thu đƣợc axit

3a hiệu suất 70%. Axit 3a là các chất rắn màu trắng có điểm chảy là 98-100oC. Dung dịch của hỗn hợp gồmaxit 3a (0,36 mmol), (COCl)2(1,8 mmol) và 0,1 ml DMF trong 5ml CH2Cl2 đƣợc khuấy ở nhiệt độ thƣờng trong 24h. Kết thúc phản ứng, loại bỏ dung môi CH2Cl2ở áp suất thấp thu đƣợc sản phẩm 2- phenoxy clorua axetat 4a.

26

Dẫn xuất 2-(m-clo phenoxy) clorua axetat 4b đƣợc tổng hợp tƣơng tƣ̣ nhƣ

4a. Nguyên liê ̣u đầu là m-clophenol 1b, thu đƣợc axit 3b vớ i hiê ̣u xuất 50%, điểm nóng chảy tƣơng ƣ́ng là 108-110o

C.

Sơ đồ 2.1. Tổng hợp dẫn xuất 2-phenoxy clorua axetic

2.2.2. Tổng hợp dẫn xuất imine

Dung dịch của benzylamin(18,7 mmol) 6a, p-brom benzanđehit (18,7 mmol) 7a và Na2SO4 (37,4 mmol) đƣợc đun hồi lƣu ở 50-60oC trong dung môi CH2Cl2, trong thời gian 4h. Hỗn hợp sau phản ứng đƣợc chiết hai lần bằng CH2Cl2, làm khan bằng Na2SO4 và loại bỏ dung môi ở áp suất thấp thu đƣợc các dẫn xuất imine 8a, đƣợc sử dụng ngay cho phản ứng tiếp theo.

Dẫn xuất imine 8b đƣợc tổng hợp tƣơng tƣ̣ nhƣ 8a. Nguyên liệu đầu là 6a

và dẫn xuất p-metoxy benzanđehit 7b.

Dẫn xuất imine 8c đƣợc tổng hợp tƣơng tự nhƣ 8a. Nguyên liệu đầu là 6b

và dẫn xuất p-metoxy benzanđehit 7b.

27

2.2.3. Tổng hợp các dẫn xuất β- lactam

Hợp chất 4a (0,75 mmol) đƣợc hòa tan vào 5 ml toluen sau đó dung môi toluen đƣợc cất loại ở áp suất thấp để loại bỏ (COCl)2 còn dƣ, tiếp theo làm lạnh và thêm Et3N (1,125 mmol) thu đƣợc dẫn xuất ketene 5a, sau đó cho thêm chất

8a (0,75 mmol)và dung môi CH2Cl2(5 ml), đun hồi lƣu ở 55oC trong 24h. Hỗn hợp sau phản ứng đƣợc chiết hai lần bằng CH2Cl2, làm khan bằng Na2SO4 và loại bỏ dung môi ở áp suất thấp. Sau đó làm sạch bằng cột silica gel với hệ dung