3. Nội dung nghiên cứu
2.4.6. Phương pháp xử lý số liệu
Mỗi nhóm thí nghiệm được lặp lại 3 lần, mỗi nhóm nghiệm được tra 4 lỗ, mỗi lỗ tiến hành chụp 4 ảnh. Số liệu thu được xử lý bằng phần mền SAS phiên bản 6.12, với P<0.05.
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Ảnh hƣởng của PG đến các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa máu và sự sinh sản của tế
3.1.1. Ảnh hưởng của PG đến các chỉ tiêu sinh lý máu
Tiến hành bổ sung PG ở các nồng độ 1 - 10 - 100 ng/ml vào môi trường nuôi cấy, chúng tôi thu được kết quả cụ thể như sau:
Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của PG đến số lƣợng hồng cầu, bạch cầu và hàm lƣợng huyết sắc tố máu của phôi gà (n=30)
Chỉ tiêu Nồng độ (ng/ml) 0 1 10 100 x X m Cv% X mx Cv% X mx Cv% X mx Cv% Hồng cầu (×106/mm3) 2,78±0,05 5,65 2,82±0,07 5,75 2,85±0,09 6,45 2,78±0,06 6,75 Bạch cầu (nghìn/mm3) 24,35±1,32 6,53 24,05±1,75 7,15 24,15±1,97 8,20 24,01±2,00 9,25 Hemoglobin (g%) 9,05±0,35 10,15 9,24±0,45 9,15 9,15±0,67 11,01 9,27±1,05 10,35 3.1 chúng tôi thấy rằng, dưới tác động của PG, số lượng hồng cầu, bạch cầu và hàm lượng Hemoglobin (Hb) đều có sự thay đổi. Tuy nhiên, mức độ biến động số lượng hồng cầu, bạch cầu không có sự sai khác rõ rệt (P > 0,05).
Sự tăng, giảm của hàm lượng Hb không theo quy luật. Cụ thể: ở nồng độ PG: 1-10-100 ng/ml thì hàm lượng Hb tương ứng là: 9,24 - 9,15 - 9,27.
Theo Lê Văn Liễn và cs (2003) nghiên cứu trên đối tượng gà Ri, gà H’Mông, gà Tè, gà Tam Hoàng và gà Kabir ở 15 tuần tuổi có số lượng hồng cầu tương ứng là: 2,35 - 2,78 - 1,86, 2,36 - 2,11 triệu/ mm3
, số lượng bạch cầu tương ứng 24,05 - 28,30, 21,74 - 24,07 - 22,30 nghìn/mm3
cầu phụ thuộc vào tuổi, tính biệt, chế độ dinh dưỡng và nhiệt độ môi trường. Số lượng bạch cầu phụ thuộc vào thuộc vào tình hình bệnh tật, điều kiện ngoại cảnh, nuôi dưỡng và là tấm gương phản ánh tình hình sức khỏe của gia cầm [8]. : PG không làm tăng số lượng cầu, bạch cầu và hàm lượng Hemoglobin trong máu. Còn sự tăng giảm của hàm lượng Hb không theo quy luật, có thể là do các tác động khác, không hoàn toàn chịu ảnh hưởng của PG.
3.1.2. Ảnh hưởng của PG đến các chỉ tiêu sinh hóa máu
Albumin là thành phần chủ yếu cấu tạo nên protein huyết thanh. Chính vì vậy mà trong quá trình sinh trưởng và phát triển của động vật, hàm lượng tương đối hay tỷ lệ phần trăm của albumin thường biến động đồng thời với hàm lượng protein huyết thanh. Để đánh giá ảnh hưởng của PG đến các chỉ tiêu sinh hóa máu, chúng tôi tiến hành phân tích các chỉ tiêu hàm lượng protein và các tiểu phần protein huyết thanh. Kết quả thu được được trình bày trong bảng 3.2.
Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của PG đến hàm lƣợng protein và các tiểu phần protein huyết thanh (gam/lít)
Chỉ tiêu Nồng độ (ng/ml) 0 1 10 100 x X m Cv% X mx Cv% X mx Cv% X mx Cv% Protein toàn phần 50,44±1,48 8,75 51,50±3,25 7,45 52,40±1,60 7,10 51,20±1,32 7,70 Albumin 20,20±1,30 11,31 21,33±1,50 11,20 21,35±1,30 11,17 21,27±2,34 12,26 α- globulin 5,850±2,20 14,00 5,92±0,37 13,05 5,96±0,32 14,28 5,80±0,35 12,90 β- globulin 6,60±0,32 13,25 7,08±0,25 13,50 7,28±0,31 14,30 7,20±0,20 13,65 γ- globulin 8,15±0,50 12,20 8,45±0,35 12,70 8,40±0,50 14,25 8,25±0,45 13,25 A/G 0,980 0,992 0,993 1,000
Từ bảng kết quả trên cho thấy: hàm lượng protein toàn phần, hàm lượng albumin và các tiểu phần globulin ở nhóm đối chứng và nhóm thí nghiệm đều không có sự sai khác rõ rệt (P>0,05).
Theo Kalior và Lê Khắc Thận (trích dẫn của Trần Thanh Vân và cs, 1997) thì protein huyết thanh phụ thuộc vào hướng sản xuất của giống, cường độ đẻ. Giống vịt hướng trứng có hàm lượng protein huyết thanh cao hơn vịt kiêm dụng và vịt chuyên thịt [13]. Nguyễn Thị Minh và cs, 2001 thì γ-globulin giữ vai trò rất quan trọng, nó có chứa kháng thể trong huyết thanh, các protein
miễn kháng và khả năng kháng bệnh c - ng như
một tiêu chí để đánh giá khả năng kháng bệnh, thích nghi với điều kiện môi trường [9]. Hệ số A/G không có sự chênh lệch
: 1-10-0,992; 0,993; 1,00 (P > 0,05), cho nên có thể kết luận rằng: 0,992; 0,993; 1,00 (P > 0,05), cho nên có thể kết luận rằng: PG không có ảnh hưởng đến chỉ tiêu sinh hóa máu nói chung.
3.1.3. Ảnh hưởng của PG đến khả năng sinh sản của tế bào hạt
Tiến hành nuôi cấy tế bào hạt, sau khi được nuôi cấy 16 giờ, quan sát thấy tế bào bám chặt vào đáy bản nuôi cấy, hình thành các đường gân nhỏ, hình thái tròn nhỏ.
. Sau , quan sát thấy tế bào hạt cơ bản bám chặt dàn đều khắp đáy bản nuôi cấy, xuất hiện hình thái lập phương nổi rõ, hình thành tầng đơn duỗi thẳng đan xen lẫn nhau, hình thái tế bào hạt rõ ràng, cảm quan hình khối tăng, số lượng tế bào hạt tăng mạnh (Hình 3.2).
Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của PG đến khả năng sinh sản của tế bào hạt
Chỉ tiêu đánh giá Nồng độ PG (ng/ml)
0 1 10 100
Số lượng tế bào/mm2
935,25 1214,54 1431,50 1285,45
Ảnh hưởng của PG đến khả năng sinh sản của tế bào hạt được chúng tôi thể hiện ở Hình 3. 3.2.
Tra PG ở nồng độ từ 1-100ng /ml thấy số lượng tế bào hạt ở lô thí nghiệm tăng so với lô đối chứng (p<0.05), kết quả cho thấy PG có ảnh hưởng
đến khả năng s h 3.1). Đồng thời, tiến h
u đậm nhạt tăng ở mức độ mạnh. Chỉ số PCNA-LI ở nhóm thí nghiệm tăng cao so với nhóm đối chứng (P<0.05).
3.1: Ảnh hưởng của PG đến sự sinh sản của tế bào hạt. Số lượng tế bào hạt thay đổi sau khi được nuôi cấy với PG (1-100 ng/ml) trong 24 giờ. bào hạt thay đổi sau khi được nuôi cấy với PG (1-100 ng/ml) trong 24 giờ.
Không cùng chữ cái kết quả có sự khác biệt rõ rệt (P<0.05,n=4).
Hình thái tế bào tách ra từ tế bào trứng màu vàng nhỏ được nuôi cấy với PG sau 24h.
Hình 3.2. Đặc điểm hình thái tế bào hạt được tách ra từ tế bào hạt màu vàng nhỏ (SYF) sau 24h nuôi cấy. Từ (A) đến (D) tương ứng với các nhóm: A (đối chứng); B (10ng/ml); C (1ng/ml); D (100ng/ml), (Độ phóng đại: 200x, Thước
đo: 10 um).
: Sử dụng tế bào hạt tinh sạch trong nuôi cấy, chúng tôi thấy rằng số lượng và chỉ số PCNA-LI của tế bào hạt được tăng lên từ tế bào hạt của SYF bởi chất hoạt hóa của PKC. Một vài gần đây đã khẳng định rằng tín hiệu dẫn đường của PKC có vai trò quan trọng thúc đẩy steroidogenesis trong phân hóa tế bào hạt từ các tế bào trứng trước khi rụng [26, 27].
Do vậy, PG có thể điều tiết sự tổng hợp steroid thông qua sự hóa của PKC trong các tế bào hạt, có một vài steroid có chức năng quan trọng trong tế bào g thông qua paracrine dẫn đường.
3.
Dựa trên kết quả nuôi cấy tế bào hạt ở tế bào trứng màu vàng nhỏ, xác định được ở nồng độ PG 10ng/ml tế bào sinh trưởng đạt mật độ cao nhất. Tiến hành nuôi cấy nguyên tế bào trứng ở tầng trước (Proliferation follicles) gồ
- -
(LYF): 6-9 mm. Chúng tôi thu được kết quả như sau:
3.2.1. Ảnh hưởng của PG đến sự phát triển của độ dày màng tế bào hạt
Nuôi cấy nguyên tế bào trứng trong dung dịch ITS sau 16 giờ, tiến hành thay bằng dung ITS có chứa 10 ng/ml PG nuôi cấy trong 24 giờ. Tiến hành làm hình thái tổ chức học và nhuộm màu bằng phương pháp HE, sau đó đo độ dày lớp màng tế bào trứng bằng phần mền chuyên dụng kết quả cho thấy: Ở tế bào trứng SWF, LWF, SYF và LYF độ dày lớp tế bào hạt tăng lên so với nhóm đối chứng tương ứng là: 34.04%, 29.87%, 30.68% và 38.13% (Hình 3.4). c cd ed e a ab b cd 0 10 20 30 40 50 SWF LWF SYF LYF Th ic kn es s of g ra nu lo sa l ay er （ um ) -PG +PG
3.3: Ảnh hưởng của PG đến độ dày của màng tế hạt sau 24 giờ nuôi cấy. Không cùng chữ cái kết quả có sự khác biệt rõ rệt (n=4, P<0,05). cấy. Không cùng chữ cái kết quả có sự khác biệt rõ rệt (n=4, P<0,05).
Hình 3.4. Hình thái của tầng tế bào hạt, tầng màng tế bào ở tầng trước tế
bào trứng sau 24 giờ . (A) đế chứ (H)
nhóm thí nghiệm. A-E: SWF; B-F: LWF; C-G: SYF; D-H: LYF. (Độ phóng đại: 1000x, Thước đo: 20 um).
3.4 cho thấy số lượng tế bào hạt tăng mạnh ở lô thí nghiệ
, đặc biệt là ở tế bào trứng màu vàng lớn với 3 đến 4 lớp tế bào.
3.2.2. Ảnh hưởng của PG đối với độ dày tầng màng tế bào
Tiến hành nghiên cứu hình thái tổ chức học và phân tích thống kê. Kết quả cho thấy: Ở tế bào trứng SWF, LWF, SYF và LYF độ dày lớp màng tế bào tăng lên so với nhóm đối chứng tương ứng là: 43.36%, 57.65%, 50.68% và 18.75% (Hình 3.4 v 3.5). f ef ed d c b ab a 0 20 40 60 80 100 120 140 SWF LWF SYF LYF T h i c k n e s s o f t h e c a l a y e r ( u m ) -PG +PG1
3.5: Ảnh hưởng của PG đến độ dày của màng tế trứng sau 24 giờ nuôi cấy. Không cùng chữ cái kết quả có sự khác biệt rõ rệt (n=4, P<0,05). cấy. Không cùng chữ cái kết quả có sự khác biệt rõ rệt (n=4, P<0,05). 3.2.3. Ảnh hưởng của PG tới khả năng sinh trưởng của số lượng tế bào hạt
Tiến hành nghiên cứu hình thái tổ chức học và phân tích thống kê. Kết quả cho thấy: tầng trước tế bào trứng SWF, SYF và LYF ở nhóm thí nghiệm có
số lượng tế bào hạt tăng thêm so với nhóm đối chứng là: 14.05%, 10.91% và 9.73% (Hình 3. 3.6) P<0.05%. bc cd d f a ab bcd e 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000 SWF LWF SYF LYF G r a n u lo sa c e ll n u m b e r (/ m m 2 ) -PG1 +PG1
3.6: PG nuôi cấy sau 24 giờ số lượng các tế bào hạt của
. Không cùng chữ cái kết quả có sự khác biệt rõ rệt
: Trong thí nghiệm, chúng tôi đánh giá vai trò của PG đối với sự sinh sản của các tế bào hạt từ SWF, LWF, SYF, LYF. Đầu tiên nuôi cấy toàn bộ tế bào trứng nhằm nghiên cứu tác dụng của PG trong việc điều tiết sự sinh sản của tế bào hạt trong SWF, LWF, SYF, LYF. Sau khi nuôi cấy SWF, LWF, SYF LYF trong nồng độ 10 ng/ml GS, có thể nhận thấy số lượng của các tế bào hạt tăng lên, độ dày của lớp màng tế bào của tế bào trứng cũng tăng lên rõ rệt. Chúng tôi nhận thấy sự sinh sản của tế bào hạt ở nhóm thí nghiệm về số lượng lớn hơn so với nhóm đối chứng. Thí nghiệm chứng tỏ PG có khả năng thúc đẩy sự sinh sản tế bào hạt ở tế bào trứng gà thông qua tác dụng trực tiếp đến các tế bào hạt.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
1. Kết luận
1. PG không ảnh hưởng đến các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa máu ở giai đoạn phôi.
2. PG ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của tế bào hạt màu vàng nhỏ ở tầng trước tế bào trứng gà, ảnh hưởng lớn nhất ở nồng độ 10ng/ml đạt: 1431,50 tế bào/ mm2
.
3. PG có khả năng thúc sự phát triển của độ dày màng tế bào hạt ở tế bào trứng SWF, LWF, SYF và LYF độ dày lớp tế bào hạt tăng lên so với nhóm đối chứng tương ứng là: 34.04%, 29.87%, 30.68% và 38.13%.
4. PG có khả năng thúc sự phát triển của độ dày màng tế ở tế bào trứng SWF, LWF, SYF và LYF độ dày lớp màng tế bào tăng lên so với nhóm đối chứng tương ứng là: 43.36%, 57.65%, 50.68% và 18.75%.
5. Ảnh hưởng của PG tới khả năng sinh tế bào hạt ở các tế bào trứng SWF, SYF và LYF số lượng tế bào hạt tăng lên so với nhóm đối chứng là: 14.05%, 10.91% và 9.73%.
2. Đề nghị
Sử dụng sinh học phân tử đánh giá
ảnh hưởng của PG đến khả năng sinh sản của tế bào hạt ở tầng trước tế bào trứng.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
I. Tài liệu tiếng Việt
1. Trịnh Bình (CB), Nguyễn Thị Bình, Nguyễn Ngọc Hùng, Nguyễn Khang Sơn, Ngô Duy Thìn, Lưu Đình Mùi, (2007), Mô - Phôi, Nhà xuất bản Y học. 2. Trần Cừ, Cù Xuân Dần, Lê Thị Minh (1972), Giáo trình sinh lý học gia
súc, Trường Đại học Nông nghiệp I, Hà Nội.
3. Cù Xuân Dần, Nguyễn Xuân Tịnh, Tiết Hồng Ngân, Nguyễn Bá Mùi, Lê Mộng Loan, (1996), Sinh lý học gia súc, Nhà xuất bản nông nghiệp, Hà Nội. 4. Trương Xuân Dung (1996), Thực hành sinh lý người và động vật, Xưởng
in Trường Đại học Sư phạm, Đại học Quốc gia Hà Nội.
5. Nguyễn Văn Gắc, Nguyễn Lương Hiền, Lưu Trọng Hiếu (1977), Dịch pha loãng để đếm hồng cầu, Tập san khoa học kỹ thuật nông nghiệp (số 2/1977), Trường Đại học Nông nghiệp 4, Thành phố Hồ Chí Minh, tr. 65. 6. Nguyễn Duy Hoan, Trần Thanh Vân (1998), Giáo trình chăn nuôi gia
cầm, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội.
7. (2006),
.
8. Lê Văn Liễn, Phạm Ngọc Uyển (2003), Xác định một số chỉ tiêu sinh lý liên quan đến khả năng kháng tự nhiên của gà Viêt Nam, Những vấn đề cơ bản trong khoa học sự sống, NXB Nông nghiệp, trang 485-488.
9. Nguyễn Thị Minh (2001), Nghiên cứu một số tính năng sản xuất và chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa máu trong việc bảo tồn quỹ gen dòng vịt Cỏ màu cánh xẻ, Luận án Tiến sĩ khoa học nông nghiệp, Viện KHKTNN Việt Nam.
10. Lê Khắc Thận, Nguyễn Thị Phước Nhuận (1974), Giáo trình sinh hóa học động vật, Trường Đại học Nông nghiệp I, Hà Nội
11. Đặng Đức Trạch, Nguyễn Đình Hướng, Phạm Mạnh Hùng, Pondman P.W, Wright. P.E (1984), Miễn dịch học, University press, University of Amsterdam, Holand.
12. Lê Đức Trình, Nguyễn Hồng Quế, Hoàng Thị Bích Ngọc (1995), Thực tập Hóa sinh, Nhà xuất bản Y học.
13. Trần Thanh Vân, Hoàng Văn Tiệu, Nguyễn Khánh Quắc (1997), Kết quả nghiên cứu một số chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa máu vịt khakhicambell, vịt Cỏ và co lai F1 của chúng nuôi bán chăn thả tại Thái Nguyên, Báo cáo khoa học CNTY, Hội nghị Khoa học Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, 8/1997, Nha Trang, Khánh Hòa
II. Tài liệu tiếng Anh
14. A. G. Hernandez and J. M. Bahr (2003), Role of FSH and epidermal growth factor (EGF) in the initiation of steroidogenesis in granulosa cells associated with follicular selection in chicken ovaries, Reproduction; 125: 683-691.
15. A. P. McElroy, D. J. Caldwell, J. A. Proudman, and B. M. Hargis (2004), Modulation of in vitro DNA synthesis in the chicken Ovarian Granulosa cell follicular Hierarchy by Follicle-stimulating Hormone and Luteinzing Hormone, Poultry Science; 83: 500-506.
16. Barbara Jana, Jan Kucharski, Anna Dzienis, Katarzyna Deptuła (2007), Changes in prostaglandin production and ovarian function in gilts during endometritis induced by Escherichia coli infection, Animal Reproduction Science; 97: 137-150.
17. Goldblatt MW (May 1935), Properties of human seminal plasma, J Physiol 84 (2): 208-18.
18. Jin Y, Chen R, Liu W, Fu Z (2010), Effect of endocrine disrupting chemicals on the transcription of genes related to the innate immune system in the early developmental stage of zebrafish (Danio rerio), Fish and shellfish immunology, 28(5-6):854-61
19. Jin YM, Zhang CQ, Lin XH, Zeng WD, Prostaglandin involvement in follicle-stimulating hormone-induced proliferation of granulosa cells from chicken prehierarchical follicles, Prostaglandins Other Lipid Mediat 2006; 81:45-54.
20. Nomura O, Nakabayashi O, Nishimori K, Yasue H, Mizuno S (1999), Expression of five steroidogenic genes including aromatase gene at early developmental stages of chicken male and female embryos, J Steroid Biochem Mol Biol; 71:103-9.
21. Phillips W.D - Chilton T.J (1991), Biology, Oxford University Press, A.Level, p. 256-257.
22. Sune K. Bergstrom, Bengt I. Samuelsson and John R, Vane (1982), for their discoveries concerning prostaglandins and related biologically active substances, The Nobel Prize in Physiology or Medicine.
23. Vane, J R (1971), Inhibition of prostaglandin synthesis as a mechanism of action for aspirin-like drugs, Nature New Biol, (1971 Jun 23) 231 (25):