3. Nội dung nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp tách chiết lấy máu
Trứng gà được mang vào ấp ở nhiệt độ 38oC, độ ẩm 60% sau 8 ngày ấp tiến hành tra dung dịch PG với nồng độ 10 ng/ml, tiếp tục ấp đến 18 ngày tiến hành lấy máu phân tích các chỉ số sinh lý, sinh hóa máu.
2.4.2. Phương pháp phân t h các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa máu
- Xác định lượng hồng cầu bằng buồng đếm Newbauer [4]. - Định lượng huyết sắc tố bằng huyết sắc kế Shali [4].
- Xác định protein tổng số trong huyết thanh bằng phản ứng Grornall [5]. - Xác định các tiểu phần protein huyết thanh bằng phương pháp điện di trên thạch aga 1% [12].
2.4.3. Phương pháp xử lý và nuôi cấy nguyên tế bào trứng
Giống gà Hyline đang trong giai đoạn sinh sản đ lựa chọn, sau khi giết mổ tiến hành mổ chọn các tế bào trứng có đường kính: SWF 1-3 mm, LWF 3-5 mm, SYF 5-6 mm, và LYF 6-9 mm [25]. Loại bỏ dịch treo và r sạch bằng dung nước muối sinh lý 0,9% diệt trùng, tiến hành nuôi cấy bằng bản nuôi cấy 24 lỗ, mỗi lỗ nuôi cấy 1 tế bào trứng tra 1ml dịch nuôi cấy M199 (Hyclone, Utah) bổ sung 10 μg/ml insulin, 5 μg/ml transferrin and 3×10-8 M selenite (Sigma, St. Louis, MO, USA).
Nhóm thí nghiệm được bổ sung 10 ng/ml PG (Sigma, St. Louis, MO, USA).
Sau 24 giờ nuôi cấy, các tế bào trứng sẽ được cố định trong dung d 4% formaldehyde, cố định tế bào trứng sau 24h tiến hành các bước nghiên cứu cấu tạo tổ chức học.
2.4.4. Phương pháp xử lý và nuôi cấy tế bào hạt
Tế bào trứng màu vàng (SYF 5-6 mm) được rửa sạch và
M199 lạnh (Hyclone, Utah). Sau đó tiến hành bóc tách tế
phân tách thành các tế bào đơn bởi nồng độ 12.5 ug/ml collagenase. Sau khi được phân tách thành các tế bào đơn các tế bào hạt sẽ được nuôi cấy bằng bản nuôi cấy 96 (Nunc, Denmark) với mật độ 5×104/lỗ, tra 200 μl M199 bổ sung 0,5% FCS (FCS, GIBCO BRL).
Tế bào được nuôi cấy trong điều k 95% atmosphere, 5% CO2 ở nhiệt độ 39oC. Sau 16h nuôi cấy, các tế bào sinh sản bám chặt vào đáy của bản nuôi cấy tiếp tục tiến hành đổi 0,5% FCS bằng dung dịch ITS (nhóm đối chứng) bổ sung 10 μg/ml insulin, 5 μg/ml transferrin and 3×10-8 M selenite (Sigma, St. Louis, MO, USA). Nhóm thí nghiệm dùng PG (hãng Sigma) với nồng độ 1- 10 ng/ml (phương thức nuôi cấy độc lập).
2.4.5. Phương pháp hóa miễn dịch PCNA
Các tế bào sau 24 giờ nuôi cấy được cố định bằng 4% formaldehyte trong 30 phút để ở nhiệt độ phòng, sau đó được xử lý 3% H2O2 làm kiệt chất nội sinh peroxidase. Hóa miễn dịch học PCNA được sử dụng theo phương pháp của Jin và cs (2010) [18].
Sử dụng kháng thể đa dòng mouse anti-PCNA (Boster Co., Wuhan, China). Nhân của tế bào dương tính sẽ bắt mầu nâu nhạt. Chỉ số PCNA- LI được tính dựa trên tế bào có nhân màu nâu nhạt chia cho tổng số tế bào đếm được trong một ảnh chụp.
2.4.6. Phương pháp xử lý số liệu
Mỗi nhóm thí nghiệm được lặp lại 3 lần, mỗi nhóm nghiệm được tra 4 lỗ, mỗi lỗ tiến hành chụp 4 ảnh. Số liệu thu được xử lý bằng phần mền SAS phiên bản 6.12, với P<0.05.
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Ảnh hƣởng của PG đến các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa máu và sự sinh sản của tế
3.1.1. Ảnh hưởng của PG đến các chỉ tiêu sinh lý máu
Tiến hành bổ sung PG ở các nồng độ 1 - 10 - 100 ng/ml vào môi trường nuôi cấy, chúng tôi thu được kết quả cụ thể như sau:
Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của PG đến số lƣợng hồng cầu, bạch cầu và hàm lƣợng huyết sắc tố máu của phôi gà (n=30)
Chỉ tiêu Nồng độ (ng/ml) 0 1 10 100 x X m Cv% X mx Cv% X mx Cv% X mx Cv% Hồng cầu (×106/mm3) 2,78±0,05 5,65 2,82±0,07 5,75 2,85±0,09 6,45 2,78±0,06 6,75 Bạch cầu (nghìn/mm3) 24,35±1,32 6,53 24,05±1,75 7,15 24,15±1,97 8,20 24,01±2,00 9,25 Hemoglobin (g%) 9,05±0,35 10,15 9,24±0,45 9,15 9,15±0,67 11,01 9,27±1,05 10,35 3.1 chúng tôi thấy rằng, dưới tác động của PG, số lượng hồng cầu, bạch cầu và hàm lượng Hemoglobin (Hb) đều có sự thay đổi. Tuy nhiên, mức độ biến động số lượng hồng cầu, bạch cầu không có sự sai khác rõ rệt (P > 0,05).
Sự tăng, giảm của hàm lượng Hb không theo quy luật. Cụ thể: ở nồng độ PG: 1-10-100 ng/ml thì hàm lượng Hb tương ứng là: 9,24 - 9,15 - 9,27.
Theo Lê Văn Liễn và cs (2003) nghiên cứu trên đối tượng gà Ri, gà H’Mông, gà Tè, gà Tam Hoàng và gà Kabir ở 15 tuần tuổi có số lượng hồng cầu tương ứng là: 2,35 - 2,78 - 1,86, 2,36 - 2,11 triệu/ mm3
, số lượng bạch cầu tương ứng 24,05 - 28,30, 21,74 - 24,07 - 22,30 nghìn/mm3
cầu phụ thuộc vào tuổi, tính biệt, chế độ dinh dưỡng và nhiệt độ môi trường. Số lượng bạch cầu phụ thuộc vào thuộc vào tình hình bệnh tật, điều kiện ngoại cảnh, nuôi dưỡng và là tấm gương phản ánh tình hình sức khỏe của gia cầm [8]. : PG không làm tăng số lượng cầu, bạch cầu và hàm lượng Hemoglobin trong máu. Còn sự tăng giảm của hàm lượng Hb không theo quy luật, có thể là do các tác động khác, không hoàn toàn chịu ảnh hưởng của PG.
3.1.2. Ảnh hưởng của PG đến các chỉ tiêu sinh hóa máu
Albumin là thành phần chủ yếu cấu tạo nên protein huyết thanh. Chính vì vậy mà trong quá trình sinh trưởng và phát triển của động vật, hàm lượng tương đối hay tỷ lệ phần trăm của albumin thường biến động đồng thời với hàm lượng protein huyết thanh. Để đánh giá ảnh hưởng của PG đến các chỉ tiêu sinh hóa máu, chúng tôi tiến hành phân tích các chỉ tiêu hàm lượng protein và các tiểu phần protein huyết thanh. Kết quả thu được được trình bày trong bảng 3.2.
Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của PG đến hàm lƣợng protein và các tiểu phần protein huyết thanh (gam/lít)
Chỉ tiêu Nồng độ (ng/ml) 0 1 10 100 x X m Cv% X mx Cv% X mx Cv% X mx Cv% Protein toàn phần 50,44±1,48 8,75 51,50±3,25 7,45 52,40±1,60 7,10 51,20±1,32 7,70 Albumin 20,20±1,30 11,31 21,33±1,50 11,20 21,35±1,30 11,17 21,27±2,34 12,26 α- globulin 5,850±2,20 14,00 5,92±0,37 13,05 5,96±0,32 14,28 5,80±0,35 12,90 β- globulin 6,60±0,32 13,25 7,08±0,25 13,50 7,28±0,31 14,30 7,20±0,20 13,65 γ- globulin 8,15±0,50 12,20 8,45±0,35 12,70 8,40±0,50 14,25 8,25±0,45 13,25 A/G 0,980 0,992 0,993 1,000
Từ bảng kết quả trên cho thấy: hàm lượng protein toàn phần, hàm lượng albumin và các tiểu phần globulin ở nhóm đối chứng và nhóm thí nghiệm đều không có sự sai khác rõ rệt (P>0,05).
Theo Kalior và Lê Khắc Thận (trích dẫn của Trần Thanh Vân và cs, 1997) thì protein huyết thanh phụ thuộc vào hướng sản xuất của giống, cường độ đẻ. Giống vịt hướng trứng có hàm lượng protein huyết thanh cao hơn vịt kiêm dụng và vịt chuyên thịt [13]. Nguyễn Thị Minh và cs, 2001 thì γ-globulin giữ vai trò rất quan trọng, nó có chứa kháng thể trong huyết thanh, các protein
miễn kháng và khả năng kháng bệnh c - ng như
một tiêu chí để đánh giá khả năng kháng bệnh, thích nghi với điều kiện môi trường [9]. Hệ số A/G không có sự chênh lệch
: 1-10-0,992; 0,993; 1,00 (P > 0,05), cho nên có thể kết luận rằng: 0,992; 0,993; 1,00 (P > 0,05), cho nên có thể kết luận rằng: PG không có ảnh hưởng đến chỉ tiêu sinh hóa máu nói chung.
3.1.3. Ảnh hưởng của PG đến khả năng sinh sản của tế bào hạt
Tiến hành nuôi cấy tế bào hạt, sau khi được nuôi cấy 16 giờ, quan sát thấy tế bào bám chặt vào đáy bản nuôi cấy, hình thành các đường gân nhỏ, hình thái tròn nhỏ.
. Sau , quan sát thấy tế bào hạt cơ bản bám chặt dàn đều khắp đáy bản nuôi cấy, xuất hiện hình thái lập phương nổi rõ, hình thành tầng đơn duỗi thẳng đan xen lẫn nhau, hình thái tế bào hạt rõ ràng, cảm quan hình khối tăng, số lượng tế bào hạt tăng mạnh (Hình 3.2).
Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của PG đến khả năng sinh sản của tế bào hạt
Chỉ tiêu đánh giá Nồng độ PG (ng/ml)
0 1 10 100
Số lượng tế bào/mm2
935,25 1214,54 1431,50 1285,45
Ảnh hưởng của PG đến khả năng sinh sản của tế bào hạt được chúng tôi thể hiện ở Hình 3. 3.2.
Tra PG ở nồng độ từ 1-100ng /ml thấy số lượng tế bào hạt ở lô thí nghiệm tăng so với lô đối chứng (p<0.05), kết quả cho thấy PG có ảnh hưởng
đến khả năng s h 3.1). Đồng thời, tiến h
u đậm nhạt tăng ở mức độ mạnh. Chỉ số PCNA-LI ở nhóm thí nghiệm tăng cao so với nhóm đối chứng (P<0.05).
3.1: Ảnh hưởng của PG đến sự sinh sản của tế bào hạt. Số lượng tế bào hạt thay đổi sau khi được nuôi cấy với PG (1-100 ng/ml) trong 24 giờ. bào hạt thay đổi sau khi được nuôi cấy với PG (1-100 ng/ml) trong 24 giờ.
Không cùng chữ cái kết quả có sự khác biệt rõ rệt (P<0.05,n=4).
Hình thái tế bào tách ra từ tế bào trứng màu vàng nhỏ được nuôi cấy với PG sau 24h.
Hình 3.2. Đặc điểm hình thái tế bào hạt được tách ra từ tế bào hạt màu vàng nhỏ (SYF) sau 24h nuôi cấy. Từ (A) đến (D) tương ứng với các nhóm: A (đối chứng); B (10ng/ml); C (1ng/ml); D (100ng/ml), (Độ phóng đại: 200x, Thước
đo: 10 um).
: Sử dụng tế bào hạt tinh sạch trong nuôi cấy, chúng tôi thấy rằng số lượng và chỉ số PCNA-LI của tế bào hạt được tăng lên từ tế bào hạt của SYF bởi chất hoạt hóa của PKC. Một vài gần đây đã khẳng định rằng tín hiệu dẫn đường của PKC có vai trò quan trọng thúc đẩy steroidogenesis trong phân hóa tế bào hạt từ các tế bào trứng trước khi rụng [26, 27].
Do vậy, PG có thể điều tiết sự tổng hợp steroid thông qua sự hóa của PKC trong các tế bào hạt, có một vài steroid có chức năng quan trọng trong tế bào g thông qua paracrine dẫn đường.
3.
Dựa trên kết quả nuôi cấy tế bào hạt ở tế bào trứng màu vàng nhỏ, xác định được ở nồng độ PG 10ng/ml tế bào sinh trưởng đạt mật độ cao nhất. Tiến hành nuôi cấy nguyên tế bào trứng ở tầng trước (Proliferation follicles) gồ
- -
(LYF): 6-9 mm. Chúng tôi thu được kết quả như sau:
3.2.1. Ảnh hưởng của PG đến sự phát triển của độ dày màng tế bào hạt
Nuôi cấy nguyên tế bào trứng trong dung dịch ITS sau 16 giờ, tiến hành thay bằng dung ITS có chứa 10 ng/ml PG nuôi cấy trong 24 giờ. Tiến hành làm hình thái tổ chức học và nhuộm màu bằng phương pháp HE, sau đó đo độ dày lớp màng tế bào trứng bằng phần mền chuyên dụng kết quả cho thấy: Ở tế bào trứng SWF, LWF, SYF và LYF độ dày lớp tế bào hạt tăng lên so với nhóm đối chứng tương ứng là: 34.04%, 29.87%, 30.68% và 38.13% (Hình 3.4). c cd ed e a ab b cd 0 10 20 30 40 50 SWF LWF SYF LYF Th ic kn es s of g ra nu lo sa l ay er （ um ) -PG +PG
3.3: Ảnh hưởng của PG đến độ dày của màng tế hạt sau 24 giờ nuôi cấy. Không cùng chữ cái kết quả có sự khác biệt rõ rệt (n=4, P<0,05). cấy. Không cùng chữ cái kết quả có sự khác biệt rõ rệt (n=4, P<0,05).
Hình 3.4. Hình thái của tầng tế bào hạt, tầng màng tế bào ở tầng trước tế
bào trứng sau 24 giờ . (A) đế chứ (H)
nhóm thí nghiệm. A-E: SWF; B-F: LWF; C-G: SYF; D-H: LYF. (Độ phóng đại: 1000x, Thước đo: 20 um).
3.4 cho thấy số lượng tế bào hạt tăng mạnh ở lô thí nghiệ
, đặc biệt là ở tế bào trứng màu vàng lớn với 3 đến 4 lớp tế bào.
3.2.2. Ảnh hưởng của PG đối với độ dày tầng màng tế bào
Tiến hành nghiên cứu hình thái tổ chức học và phân tích thống kê. Kết quả cho thấy: Ở tế bào trứng SWF, LWF, SYF và LYF độ dày lớp màng tế bào tăng lên so với nhóm đối chứng tương ứng là: 43.36%, 57.65%, 50.68% và 18.75% (Hình 3.4 v 3.5). f ef ed d c b ab a 0 20 40 60 80 100 120 140 SWF LWF SYF LYF T h i c k n e s s o f t h e c a l a y e r ( u m ) -PG +PG1
3.5: Ảnh hưởng của PG đến độ dày của màng tế trứng sau 24 giờ nuôi cấy. Không cùng chữ cái kết quả có sự khác biệt rõ rệt (n=4, P<0,05). cấy. Không cùng chữ cái kết quả có sự khác biệt rõ rệt (n=4, P<0,05). 3.2.3. Ảnh hưởng của PG tới khả năng sinh trưởng của số lượng tế bào hạt
Tiến hành nghiên cứu hình thái tổ chức học và phân tích thống kê. Kết quả cho thấy: tầng trước tế bào trứng SWF, SYF và LYF ở nhóm thí nghiệm có
số lượng tế bào hạt tăng thêm so với nhóm đối chứng là: 14.05%, 10.91% và 9.73% (Hình 3. 3.6) P<0.05%. bc cd d f a ab bcd e 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000 SWF LWF SYF LYF G r a n u lo sa c e ll n u m b e r (/ m m 2 ) -PG1 +PG1
3.6: PG nuôi cấy sau 24 giờ số lượng các tế bào hạt của
. Không cùng chữ cái kết quả có sự khác biệt rõ rệt
: Trong thí nghiệm, chúng tôi đánh giá vai trò của PG đối với sự sinh sản của các tế bào hạt từ SWF, LWF, SYF, LYF. Đầu tiên nuôi cấy toàn bộ tế bào trứng nhằm nghiên cứu tác dụng của PG trong việc điều tiết sự sinh sản của tế bào hạt trong SWF, LWF, SYF, LYF. Sau khi nuôi cấy SWF, LWF, SYF LYF trong nồng độ 10 ng/ml GS, có thể nhận thấy số lượng của các tế bào hạt tăng lên, độ dày của lớp màng tế bào của tế bào trứng cũng tăng lên rõ rệt. Chúng tôi nhận thấy sự sinh sản của tế bào hạt ở nhóm thí nghiệm về số lượng lớn hơn so với nhóm đối chứng. Thí nghiệm chứng tỏ PG có khả năng thúc đẩy sự sinh sản tế bào hạt ở tế bào trứng gà thông qua tác dụng trực tiếp đến các tế bào hạt.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
1. Kết luận
1. PG không ảnh hưởng đến các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa máu ở giai đoạn phôi.
2. PG ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của tế bào hạt màu vàng nhỏ ở tầng trước tế bào trứng gà, ảnh hưởng lớn nhất ở nồng độ 10ng/ml đạt: 1431,50 tế bào/ mm2
.
3. PG có khả năng thúc sự phát triển của độ dày màng tế bào hạt ở tế bào trứng SWF, LWF, SYF và LYF độ dày lớp tế bào hạt tăng lên so với nhóm đối chứng tương ứng là: 34.04%, 29.87%, 30.68% và 38.13%.
4. PG có khả năng thúc sự phát triển của độ dày màng tế ở tế bào trứng SWF, LWF, SYF và LYF độ dày lớp màng tế bào tăng lên so với nhóm đối chứng tương ứng là: 43.36%, 57.65%, 50.68% và 18.75%.
5. Ảnh hưởng của PG tới khả năng sinh tế bào hạt ở các tế bào trứng SWF, SYF và LYF số lượng tế bào hạt tăng lên so với nhóm đối chứng là: 14.05%, 10.91% và 9.73%.
2. Đề nghị
Sử dụng sinh học phân tử đánh giá
ảnh hưởng của PG đến khả năng sinh sản của tế bào hạt ở tầng trước tế bào trứng.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
I. Tài liệu tiếng Việt
1. Trịnh Bình (CB), Nguyễn Thị Bình, Nguyễn Ngọc Hùng, Nguyễn Khang Sơn, Ngô Duy Thìn, Lưu Đình Mùi, (2007), Mô - Phôi, Nhà xuất bản Y học. 2. Trần Cừ, Cù Xuân Dần, Lê Thị Minh (1972), Giáo trình sinh lý học gia
súc, Trường Đại học Nông nghiệp I, Hà Nội.
3. Cù Xuân Dần, Nguyễn Xuân Tịnh, Tiết Hồng Ngân, Nguyễn Bá Mùi, Lê Mộng Loan, (1996), Sinh lý học gia súc, Nhà xuất bản nông nghiệp, Hà Nội. 4. Trương Xuân Dung (1996), Thực hành sinh lý người và động vật, Xưởng
in Trường Đại học Sư phạm, Đại học Quốc gia Hà Nội.
5. Nguyễn Văn Gắc, Nguyễn Lương Hiền, Lưu Trọng Hiếu (1977), Dịch pha loãng để đếm hồng cầu, Tập san khoa học kỹ thuật nông nghiệp (số