Mẫu tế bào lấy từ tủy xương người là một mẫu phức tạp, chứa nhiều loại tếbào khác nhau. Đặc biệt số lượng hồng cầu quá lớn từ 4-6T/l, lượng huyết sắc tố nhiều (117,5-153,5g/l) gây ảnh hưởng trực tiếp đến việc phân tích các protein. Mặt khác, các protein cĩ hàm lượng cao trong huyết tương, đường, muối và mỡ
trong tủy cũng ảnh hưởng đến kết quả phân tích protein tế bào bệnh leukemia.
Để cĩ thể nghiên cứu protein trong tế bào bạch cầu bệnh leukemia thì cần phải tách các tế bào bạch cầu. Do đĩ chhúng tơi đã sử dụng Ficoll™ 400 để tách các tế bào bạch cầu.
Ficoll™ 400 F4375 là một hợp chất cao phân tử dưới dạng bột, trơ, cĩ
cấu tạo là polysucrose. Ficoll được pha với đệm PBS hoặc SBSS cho đến khi cĩ tỉ trọng thích hợp cho việc phân tách các loại tế bào theo tỉ trọng. Trong nghiên cứu này, Ficoll đã được pha với PBS đểđạt tới tỉ trọng là 1,077g/ml.
Để hiệu quả tách tếbào cao địi hỏi mẫu tủy xương phải được chống đơng
bằng EDTA hoặc heparin và việc tách tế bào khơng muộn hơn 4h sau khi tủy đã
được lấy từ bệnh nhân. Mẫu tủy được giữ ở nhiệt độ khoảng 20oC, được trộn
đều với PBS theo tỷ lệ 1:1 và rải đều lên bề mặt Ficoll cĩ tỉ trọng 1,077g/ml
đựng trong ống Eppendoff. Tiến hành ly tâm tách tế bào ở nhiệt độ 4oC. Sau khi tiến hành ly tâm, ta thu được ống mẫu với các lớp tách biệt. Lớp trên cùng là lớp dịch nổi cĩ tỷ trọng nhỏ nhất; dưới lớp này là lớp tế bào màu trắng đục chính là lớp bạch cầu. Tiếp theo là lớp Ficoll cĩ tỉ trọng lớn hơn lớp bạch cầu và cuối cùng là lớp hồng cầu màu đỏ đậm cĩ tỉ trọng lớn nhất. Như vậy với tỉ trọng là
1,077g/ml, Ficoll đã tách riêng hai lớp tế bào cĩ tỉ trọng khác nhau. Kết quả
phân tách tếbào được thể hiện ở hình 2.
Hình 2. Phân tách tế bào bạch cầu bằng Ficoll™ 400
Lớp tế bào bạch cầu được hút ra và rửa sạch nhiều lần bằng đệm PBS. Để
kiểm tra khả năng tách tế bào, chúng tơi đã tiến hành nhuộm tế bào bạch cầu bằng Giêmsa và soi tế bào trên kính hiển vi quang học. Kết quảđược trình bày
như ở hình 3 Ficoll 400 Dịch nổi Tế bào bạch cầu Hồng cầu A B
Hình 3. Ảnh chụp tế bào bạch cầu sau khi phân tách dưới kính hiển vi A: Độphĩng đại 40x; B: Độphĩng đại 100x
Trên ảnh chụp mẫu tế bào bạch cầu, ta cĩ thể thấy tồn bộ các tếbào đều bắt màu đặc trưng với thuốc nhuộm Giemsa, chứng tỏ qui trình lọc tách tế bào
đã thành cơng.
3.3. Tách chiết protein từ tế bào bạch cầu
Chúng tơi đã tiến hành nhiều phương pháp khác nhau để phá tế bào bạch cầu và tách chiết protein. Dưới đây là kết quảđiện di một chiều SDS-PAGE 10% (hình 3)
Hình 4.Điện di dịch chiết tế bào bạch cầu trên gel polyacrylamide 10% cĩ SDS Giếng 1: Mẫu được ngâm trong đệm A, giếng 2: mẫu tủa trong TCA/Acetone 10% tỉ lệ 1:3, giếng 3: mẫu được xử lý bằng sốc nhiệt -80oC và tủa trong TCA/Acetone 10% tỉ lệ 1:2, giếng 4: mẫu được xử lý bằng xốc nhiệt -
80oC và xử lý bằng ReadyPrep Cleanup Kit
Kết quả giếng 1 cho thấy ở điều kiện bình thường mẫu tế bào cĩ thể bị
hịa tan trong đệm A, cĩ thể tách chiết được các protein. Tuy nhiên, sốlượng các
băng rất ít, các băng rất dày và đặc biệt cĩ một băng rất đậm chứng tỏ cĩ một loại protein cĩ hàm lượng lớn trong mẫu. Điều này cho thấy mẫu vẫn cịn chưa
sạch, mẫu vấn cĩ nhiều tạp chất.
Để làm sạch mẫu, chúng tơi tiến hành rửa thêm tế bào và ngâm mẫu trong
đệm A rồi tủa mẫu trong TCA/Acetone 10% tỷ lệ 1:3 (1 thể tích mẫu: 3 thể tích TCA/Acetone). Kết quả điện di ở giếng 2 cho thấy lượng protein sau khi tủa mẫu là rất thấp. Nguyên nhân là do khi tủa ở tỷ lệ 1:3, protein đã khơng cịn khả năng hịa tan trởtrong đệm mẫu điện di.
Chúng tơi tiếp tục đưa mẫu tế bào sau khi tách vào tủ lạnh sâu (-80oC) để
phá vỡ tế bào bằng cách gây sốc nhiệt khi đưa ra nhiệt độ bình thường. Sau khi
ngâm đệm A và tủa theo tỷ lệ thấp hơn (1 thể tích mẫu: 2 thể tích TCA/Acetone),
chúng tơi thu được hình ảnh điện di ở giếng 3. Kết quả điện di đã cho thấy hiệu quả tách chiết theo phương pháp này đã tốt hơn.
Áp dụng qui trình trên nhưng sử dụng ReadyPrep™ Cleanup Kit thay cho việc tủa bằng TCA/Acetone, chúng tơi đã thu được kết quảnhư hình 3 giếng 4.
Theo phương pháp này, hiệu quả tách chiết protein cao hơn cả. Trên hình ảnh
điện di cĩ nhiều băng protein nhất, thể hiện được sự đa dạng của protein trong mẫu. Do đĩ dịch chiết theo phương pháp này đã được sử dụng cho điện di 2 chiều.