Hàm lượng protein trong các mẫu huyết tương được xác định bằng
phương pháp Bradford trước khi chạy điện di hai chiều để đảm bảo tính đồng nhất vềlượng protein lên mẫu điện di hai chiều giữa các mẫu nghiên cứu.
Điện di hai chiều bắt đầu bằng việc làm trương strip: dịch protein được ngâm cùng với thanh gel gradient pH cố định (IPG strip) 4-7, chiều dài 11 cm trong thời gian 14h. Trong quá trình này, protein sẽ thấm vào IPG strip. Điện di
đẳng điện được thực hiện trên hệ thống Protean IEF cell (Biorad - Mỹ) để tập trung các phân tử protein vào vị trí trên IPG strip nơi cĩ pH trùng với pI của phân tử đĩ. Quá trình chạy điện di đẳng điện diễn ra theo 3 bước nối tiếp nhau
dưới điều kiện về nguồn điện như sau:
Bảng 3. Chương trình chạy điện di đẳng điện
11 cm Hiệu điện thế (V) Thời gian (t) V.t (V-giờ) Chế độ tăng U
Bước 1 250 20 phút Tuyến tính
Bước 2 8.000 2,5 giờ Tuyến tính
Bước 3 8.000 20.000 V-giờ Nhanh
Tổng 5,5 giờ 30.000V-
giờ
Kết thúc điện di đẳng điện, các IPG strip được cân bằng trong 10 ml dung dịch đệm cân bằng I với thành phần 50 mM Tris HCl, pH 8,8; 6 M urea, 30% glycerol 2% SDS cĩ chứa 100 mg DTT. Sau đĩ tiếp tục cân bằng trong 10ml
đệm cân bằng II với thành phần tương tựnhư đệm cân bằng I chỉ thay DTT bằng 250 mg iodoacetamide.
Chiều thứ hai của điện di hai chiều được tiến hành trên gel polyacrylamide cĩ SDS (SDS-PAGE) với gel gradient 7-15% polyacrylamide.
Sau khi điện di chiều thứ hai, các gel được cố định trong 1 giờ bởi dung dịch chứa 1,3% axit phosphoric, 20% methanol và nhuộm màu qua đêm bằng Coomassie G-250 theo phương pháp nhuộm Colloidal Coomassie Brilliant Blue
của Neuhoff (1988) [26]. Phương pháp nhuộm này đạt độ nhạy cao, cĩ thể hiện lên các spot chỉ chứa 30ng protein.
