Từ cặn của dịch chiết n-hexan phân chia trên sắc ký cột silicagel, rửa rải bằng hệ dung môi n-hexan : etylaxetat (9:1) thu được chất PH-1 có Rf = 0,72.
36
37
38
Hình 3.3: Phổ 13
39
Chất PH-1 là những tinh thể hình kim, không màu, điểm nóng chảy ở 139-1410C. Khi trộn lẫn với chất chuẩn cho một hỗn hợp có nhiệt độ nóng chảy không thay đổi.
Chất PH-1 trong phổ EI-MS cho mảnh ion phân tử M+
= 414, như vậy có nghĩa khối lượng phân tử bằng 414 đvC sẽ ứng với công thức phân tử C29H50O.
Trong phân tử có một nhóm OH thể hiện ở phổ FT-IR với vân hấp thụ rộng ở ν = 3380cm-1
. Mặt khác phổ 1
H-NMR cho δ = 3,52 ppm đặc trưng cho proton trong nhóm CH liên kết với nhóm hidroxyl.
Phổ 13
C-NMR cũng nhận thấy δ = 71,7 ppm đặc trưng cho cacbon liên kết trực tiếp với oxy của nhóm hidroxyl.
Trong phân tử còn có một nối đôi thể hiện bởi các đặc trưng ở phổ FT- IR có vân ở 3010 cm-1
đặc trưng cho dao động hoá trị của liên kết C-H và vân ở 1650 cm-1đặc trưng cho dao động hoá trị của liên kết đôi C=C. Trong phổ 1
H- NMR cũng nhận được tín hiệu δ = 5,35 ppm đặc trưng cho H trong liên kết =C- H và tín hiệu của 2 cacbon mang nối đôi với δ= 140,7 ppm và δ= 121,5 ppm từ đó có thể quy kết hợp chất PH-1 có một nối đôi giữa vị trí C-5 và C-6.
So sánh phổ 1
H-NMR và phổ 13C-NMR của chất PH-1 với phổ của β- Sitosterol thấy hoàn toàn tương tự nhau (bảng 3.1). Từ các kết quả phân tích thành phần hoá học, tính chất vật lý, tính chất quang phổ nhất là dựa trên cơ sở so sánh các số liệu phổ của chất PH-1 với phổ của chất β-sitosterol hoàn toàn có thể cho phép quy kết chất PH-1 đã phân lập được từ cây chó đẻ răng cưa là β-sitosterol.
40
Bảng 3.1: Số liệu phổ 13
C-NMR (CDCl3, 125Mhz) của PH-1 trong cây
chó đẻ răng cƣa (Phyllanthus urinaria L) và phổ của -sitosterol [15]
Chất PH-1 β-Sitosterol [15] Vị trí C δ của 13 C (ppm) Vị trí C δ của 13 C (ppm) 1 37,2 1 37,2 2 31,7 2 31,6 3 71,8 3 71,7 4 42,3 4 42,3 5 140,8 5 140,7 6 121,7 6 121,7 7 31,9 7 31,9 8 31,9 8 31,9 9 50,1 9 50,1 10 36,5 10 36,5 11 21,1 11 21,2 12 39,8 12 39,8 13 42,3 13 42,3 14 56,8 14 56,7 15 24,3 15 24,3 16 28,3 16 28,2 17 56,2 17 56,1 18 11,9 18 11,9 19 19,4 19 19,4 20 36,2 20 36,1 21 18,8 21 18,9 22 33,9 22 34,0 23 26,1 23 26,1 24 45,8 24 45,8 25 29,2 25 29,2 26 19,1 26 19,8 27 19,4 27 19,5 28 23,1 28 23,0 29 11,9 29 12,0
41 2 3 4 5 10 1 6 7 8 9 13 12 17 16 21 22 24 28 29 26 27 19 18 HO 11 14 15 20 23 25 β-Sitosterol 3.3.2.5-Hydroxymetylfufural (PE-1)
Chất PE-1 được tách từ cặn etylaxetat có Rf= 0,8 (trong hệ dung môi cloroform : etylaxetat (9:1). Nó là chất dầu sệt màu nâu.
Phổ LC-MS cho biết chất PE-1 có píc ion phân tử M+
= 126,8 điều này cho thấy chất PE-1 có khối lượng phân tử 126 đvC.
Các dữ liệu phổ NMR cũng xác nhận những thông tin quan trọng. Phổ 13
C-NMR cho tín hiệu δ = 177,91 ppm, đó chính là độ chuyển dịch hóa học của cacbon cacbonyl. Ở độ chuyển dịch hóa học δ = 124,31 ppm và δ = 109,62 ppm là độ chuyển dịch của hai nguyên tử cacbon chưa no liên kết với hiđro (=C-H), có thể quy kết δ = 124,31 ppm là C-3 còn δ = 109,62 ppm là của C-4.
Từ phổ NMR kỹ thuật DEPT cho thấy có một số loại các bon như sau: hai cacbon bậc 4 ở độ chuyển dịch hóa học 151,70 ppm và 162,13 ppm đó là các nguyên tử cacbon C-2 và C-5. Có một nhóm CH2 với δ = 55,89 ppm. Có hai nhóm CH (metin) ở các độ dịch chuyển hóa học 109,62 ppm và 124,31 ppm. Theo phổ HSQC thì nguyên tử H-1 có độ dịch chuyển hóa học ở 9,54 ppm, các nguyên tử H-6a,b có độ dịch chuyển hóa học ở 4,50 ppm, nguyên tử H-3 có độ dịch chuyển hóa học ở 7,48 ppm. Còn nguyên tử H-4 có độ dịch chuyển hóa học ở 6,60 ppm.
42
43
44
Bảng 3.2: Số liệu phổ NMR của PE-1 và số liệu phổ NMR trong phần mềm ACD/NMR của hidroxymetylfufural
Vị trí C
Phổ của chất PE-1 Phần mềm ACD của
hidroxymetylfufural. 13 C- NMR (ppm) 1 H-NMR (ppm) ACD/ 13 C-NMR ACD/1H-NMR 1 177,91 9,54 179,55 9,53 2 151,70 - 156,33 - 3 124,31 7,48 121,65 7,41 4 109,62 6,60 112,74 6,68 5 162,13 - 160,22 - 6 55,89 4,50 56,63 4,70 Phân tích phổ 1
H-NMR, HMBC cho thấy tín hiệu H-1 (δ = 9,54 ppm) là độ chuyển dịch hóa học của hiđtro liên kết với nhóm C=O có tương tác xa với C-2 ở độ dịch chuyển hóa học ở 151,70 ppm và C-3 ở 124,31 ppm, H-3 (δ = 7,48ppm) có tương tác xa với các cacbon C-2 ở 151,70 ppm và C-4 ở 109,62 ppm, H-4 (1H, d, j=3,7Hz; δ = 6,60 ppm) có tương tác xa với C-3 và C-5 ở các độ dịch chuyển hóa học 124,31 ppm và 162,13 ppm. Còn các nguyên tử H-6a,b có tương tác xa với C-4 và C-5 ở các độ dịch chuyển hóa học 109,62 ppm và 162,13 ppm.
So sánh phổ NMR của chất PE-1 với phần mềm ACD/1
H-NMR và ACD/13C-NMR cho thấy sự tương tự gần như hoàn toàn với phổ của 5- hidroxymetylfufural (xem bảng 3.2).
45
Từ các kết quả phân tích các loại phổ của hợp chất PE-1như: phổ khối, phổ NMR với các kỹ thuật đo 1D và 2D, có so sánh với phần mềm mô phỏng ACD/NMR, có thể khẳng định chất PE-1 là 5-hidroxymetylfufural.
1 2 3 4 5 6 O C O H HO 5-Hidroxymetylfufural
Ngày nay chất 5-hidroxymetylfufural đã được phân lập từ một số cây thuốc dân gian khác như từ cây địa hoàng, cây trinh nữ hoàng cung nó có vai trò trong quá trình chuyển hoá chất trong cơ thể sinh vật. Trong cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria), chất 5-hidroxymetylfufural lần đầu tiên được phân lập và nhận dạng cấu trúc phân tử.
3.3.3. Axit gallic (PE-2)
Chất PE-2 cũng được tách từ cặn etylaxetat, là chất rắn kết tinh, tinh thể hình kim màu vàng có nhiệt độ nóng chảy ở 249-250o
C. Phổ 1
H-NMR cho tín hiệu 7,092 ppm ứng với 2 proton đặc trưng cho độ chuyển dịch hóa học của các proton vòng thơm, được quy kết cho các proton ở các vị trí C-2 và C-6.
Phổ 13C-NMR cho thấy các độ chuyển dịch hóa học ở δ = 120,48 ppm, δ = 137,98 ppm và δ = 167,46 ppm, tương ứng với độ chuyển dịch hóa học của các nguyên tử cacbon C1, C4 và C7 trong axit gallic. Có 2 tín hiệu ở δ = 108,73 ppm và δ = 145,40 ppm, mỗi tín hiệu ứng với 2 nguyên tử cacbon. Các tín hiệu này phù hợp với độ chuyển dịch hóa học của C2 và C6 (δ= 108,73 ppm) và của C3 và C5 (δ= 145,40 ppm).
46
47
48
So sánh phổ NMR của chất PE-2 với phần mềm ACD/1
H-NMR và ACD/13CNMR cho thấy sự tương tự gần như hoàn toàn với phổ của axit gallic (xem bảng 3.3).
Bảng 3.3: Số liệu phổ NMR của PE-2 và số liệu phổ NMR trong phần mềm ACD/NMR của axit gallic
Như vậy, có thể quy kết chất PE-2 được tách ra từ dịch chiết etylaxetat của cây chó đẻ răng cưa được nhận dạng là axit gallic.
1 COOH OH HO OH 2 3 4 5 6 7 Axit gallic
Có thể coi axit gallic là một đơn phân để tham gia vào việc tạo ra các tanin thuỷ phân và tham gia vào các chuyển hoá khác tạo ra các lignan trong cây chó đẻ răng cưa.
49
3.3.4. Kampherol (PE-3)
Chất PE-3. Từ cặn etylaxetat ngoài các chất PE-1 và PE-2 trình bày ở trên chúng tôi còn thu được một hỗn hợp có màu vàng, cho màu đỏ cam với phản ứng Xianiđin, màu xanh đen với dung dịch FeCl3 1% điều đó nói lên trong hỗn hợp này có flavonoit.
Bằng phương pháp sắc kí cột silicagel hỗn hợp thu được này, rửa giải bằng hệ dung môi toluen : etylaxetat : axitfomic (5:4:1) thu được 29mg chất rắn màu vàng (có Rf = 0,4 trong hệ dung môi E) và nóng chảy ở 276-278oC.
Phổ khối lượng LC-MS cho pic ion phân tử M+
ở m/z =286,9 và M- ở m/z =285,0 ứng với M = 286 đvC và phù hợp với công thức C15H10O6.
Phân tích phổ 13
C-NMR (DEPT) cho thấy hợp chất PE-3 có tổng cộng 15 nguyên tử cacbon trong đó có 9 C bậc 4, có 6 cacbon bậc 3 (có 6 nhóm CH), không chứa các cacbon bậc 1 và bậc 2. Có thể quy kết các tín hiệu δ = 176,58 ppm là của cacbon cacbonyl C-4; ở độ dịch chuyển hóa học δ = 147,03 ppm là của cacbon C-2; δ = 136,52 ppm là tín hiệu của C-3, đó là những nguyên tử cacbon olefin, C-2 liên kết với oxi ở vị trí số 1 còn C-3 liên kết với nhóm OH và nhóm C=O. Tín hiệu ở δ = 157,78 ppm và δ = 164,98 ppm tương ứng với độ chuyển dịch hoá học của C-5 và C-7, còn δ = 160,16 ppm là tín hiệu của C-4/
và 3 nguyên tử cacbon này liên kết trực tiếp với các nhóm hiđroxyl.
Theo phổ HSQC của hợp chất PE-3 thì tín hiệu cộng hưởng proton tại 8,15 ppm (dd, J=8,2 và 2,2) là của H-2/
và H-6/ và tại 7,01 ppm (dd, J=8,2 và 2,2) là tính hiệu của H-3/
và H-5/, còn các tín hiệu δ = 6,26 ppm và 6,52 ppm là của các nguyên tử H-6 và H-8.
50
51
52
Bảng 3.4: Số liệu phổ NMR của PE-3 và số liệu phổ trong phần mềm ACD/NMR của chất kampherol
Vị trí C
Phổ của chất PE-3 Phần mềm ACD của chất
kampherol 13 C- NMR (ppm) 1 H-NMR (ppm) ACD/13C- NMR ACD/ 1 H-NMR 2 147,03 - 146,45 - 3 136,52 - 135,60 - 4 176,58 - 175,80 - 5 157,78 - 157,63 - 6 99,17 6,26 (1H, d, J=2,1) 98,25 6,28 7 164,98 - 163,90 - 8 94,49 6,52 (1H, d, J=2,1) 93,45 6,54 9 162,30 - 159,13 - 10 104,15 - 103 - 1/ 123,32 - 121,65 - 2/ 130,44 8,15 (1H, dd, J=8,2; 2,2) 129,40 8,10 3/ 116,32 7,01(1H, dd, J=8,2;2,2) 115,35 7,00 4/ 160,16 - 159,10 - 5/ 116,32 7,01(1H, dd, J=8,2; 2,2) 115,35 7,00 6/ 130,44 8,15 (1H, dd, J=8,2; 2,2) 129,40 8,10
53
Từ phổ HMBC cho thấy H-2’(δ = 8,15 ppm) có tương tác xa với các nguyên tử cacbon C-1’ (123,32 ppm) và C-3’ (116,32 ppm), H-3’(δ = 7,01 ppm) có tương tác xa với C-2’ (130,44 ppm) và C-4’(160,16 ppm), H-5’ tương tác xa với C-4’ (160,16 ppm) và C-6’ (130,44 ppm), H-6’ tương tác xa với C- 5’ (116,32 ppm) và C-1’ (123,32 ppm), H-6 có tương tác xa với C-5 (157,78 ppm) và C-7 (164,98 ppm). Còn H-8 có tương tác xa với C-7 (164,98 ppm) và C-9 (162,30 ppm).
Qua việc phân tích các loại phổ của hợp chất PE-3 có so sánh với chương trình mô phỏng phổ ACD/1
H-NMR và ACD/13CNMR cho thấy sự tương thích khá tốt với độ sai số cho phép có thể khẳng định hợp chất PE-3 chính là kampherol. C O OH OH OH HO O 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1' 2' 3' 4 ' 5' 6/
Kampherol hay 3,5,7,4/-tetrahidroxi flavon
Kampherol là một flavonoit có trong nhiều thực vật, nó không độc và có tác dụng sinh học quan trọng. Lần đầu tiên chất này được phân lập từ cây chó đẻ răng cưa (phyllanthus urinaria) thu hái tại Thái Nguyên.
3.4. Thử hoạt tính sinh học
Căn cứ vào thực tế đã và đang được ứng dụng làm thuốc của cây chó đẻ răng cưa, chúng tôi đã tiến hành thử hoạt tính sinh học của dịch chiết của cây này tại bộ môn Vi sinh Trường Đại học Y khoa – Đại học Thái Nguyên. Mẫu thử gồm có:
54
Mẫu 1: Dịch chiết tổng số trong nước nóng.
Mẫu 2: Dịch chiết trong EtOAc (đã loại bỏ hết phần chất tan trong n-hexan). Kết quả thử hoạt tính với vi sinh vật kiểm định của dịch chiết cây chó đẻ răng cưa nêu trong bảng 2.3, cho biết các dịch chiết thô đều có hoạt tính với vi sinh vật kiểm định. Cụ thể là:
- Dịch chiết trong nước và dịch chiết etylaxetat của cây chó đẻ răng cưa đều có hoạt tính khá mạnh với các khuẩn Staphylococcusauresu (Tụ cầu vàng), E.coli (Thực khuẩn đường ruột) và Salmonella typhi (Thương hàn).
- Dịch chiết nước có hoạt tính mạnh hơn so với dịch chiết etylaxetat. - Dịch chiết nước có hoạt tính mạnh nhất với khuẩn Salmonella typhi
55
KẾT LUẬN
1. Lần đầu tiên, cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L) mọc hoang tại Thái Nguyên được nghiên cứu sàng lọc hóa thực vật, đã thiết lập được quy trình ngâm chiết mẫu hợp lí thu được 4 dịch chiết chọn lọc.
2. Từ thân và lá cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L), bằng phương pháp phân tích định tính đã khẳng định trong cây chó đẻ răng cưa có những lớp chất: đường khử, ankaloit, steroit, flavonoit, poliphenol,cumarin và saponin.
3. Đã phân lập và xác định được cấu trúc hóa học của 4 hợp chất là: β- Sitosterol, 5-hidroxymetylfufural, axit gallic và kampherol.
4. Đã thử hoạt tính sinh học của các dịch chiết tổng của cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L) cho thấy có tác dụng kháng các khuẩn
Staphylococcusauresu (Tụ cầu vàng), E.coli (Thực khuẩn đường ruột) và
56
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN
1. Ngô Đức Trọng, Phạm Văn Thỉnh (2008), “Nghiên cứu hóa học thực vật cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L.) mọc hoang tại Thái Nguyên (Chemical studies on the constituents of Phyllanthus urinaria L. growing wildly in Thai Nguyen province)”, Tạp chí Khoa học & Công nghệ Đại học Thái Nguyên, số 2 (46), tr 75-79.
57
TÀI LIỆU THAM KHẢO
A. Tài liệu tiếng Việt
1. Đỗ Huy Bích và cộng sự (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, NXB Khoa học và Kĩ thuật, Hà Nội.
2. Nguyễn Văn Đàn (1997), Các phương pháp nghiên cứu cây thuốc, NXB Y- Dược, Tp. Hồ Chí Minh.
3. Nguyễn Văn Đậu, Lưu Hoàng Ngọc, Nguyễn Đình Chung (2003), “Phân lập một số hoạt chất từ cây chó đẻ răng cưa”, Tạp chí Dược học, số 9 năm 43, tr.12-15.
4. Nguyễn Văn Đậu, Trần Thị Thu Hà (2007), “Ngiên cứu hóa thực vật cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus uticulatus niruri L)”. Tạp chí dược học, số 369 năm 47, tr.15-18.
5. Đỗ Tất Lợi (1997), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội, tr.65-67.
6. Nguyễn Thượng Dong và đồng tác giả (2001), “Khảo sát công dụng làm thuốc của một số loài Phyllanthus ở Việt Nam”, Tạp chí dược liệu, 6 (2+3), tr.72-75.
7. Trần Đình Thắng và cộng sự (2007), “Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất phenolic từ cây chó đẻ răng cưa”, Tạp chí Dược học, số 371 năm 47, tr.14-17.
B. Tài liệu tiếng Anh
8. Anjaneyulu (1973), “A. S. R et al”, Tetrahedron, 29(1), p.1291.
9. Babady-Bila (1996), “Niruroidine, a norsecurinine-type alkaloid from
Phyllanthus niruroides”, Phytochemistry, 41(5), p.1441-1443.
10. Bikram Singh, P.K. Agrawal and R.S. Thakur (1989), “An acyclic triterpene from Phyllanthus niruri”, Phytochemistry, 28(7), p.1980-1981.
58
11. Calixto J. B., Santos A. R. (1998), “A review of the plants of the genus
Phyllanthus”, Pharmacology, 4(18), p.225-258.
12. Chia-Chuan Chang, Yu-Chin Lien (2003), “Four lignans were isolated from Phyllanthus urinaria L”, Phytochemistry, 63(7), p.825-833.
13. Chien-Min Yang, Hua-Yew Cheng (2007), “Geraniin from Phyllanthus urinaria L”, Ethnopharmacology, 110(3), p.555-558.
14. Farah Naaz, Saleem Javed, M.Z. Abdin (2007), “Hepatoprotective effect of ethanolic extract of Phyllanthus amarus Schum. et Thonn”,
Ethnopharmacology, 113(3), p.503-509.
15. Goat J.L., Akihisa T. (1997), “Analysis of steroit frest ed.”, Phytochemistry,