L ỜI CẢM ƠN
3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.2. Các chỉ tiêu theo dõi
Cây mạch môn ñược theo dõi về các chỉ tiêu sinh trưởng, chỉ tiêu về
sinh lý , giải phẫu như sau:
a. Các chỉ tiêu về sinh trưởng
• Chiều cao bụi cây (cm) : ñặt tấm bìa ngang trên tán ño chiều cao từ mặt
ñất ñến mặt dưới của tấm bìa, mỗi ô thí nghiệm ño toàn bộ số cây/ô.
• Số nhánh/bụi: ñếm số nhánh có lá thật của bụi mạch môn
• Chiều rộng lá (cm): ño vị trí rộng nhất của lá
• Chiều dài lá (cm): ño từ nách lá ñến ñiểm tận cùng của lá
• Số lá/cây : ñếm toàn bộ số lá /cây
• Số củ, số rễ/cây: ñếm toàn bộ số củ, số rễ có trên một bụi
• Khối lượng củ, khối lượng rễ, thân lá của bụi mạch môn (g/bụi): cân toàn bộ khối lượng cũ, rễ, thân lá tiến hành sấy và cân khối lượng củ, rễ, thân lá khô vào lần ño cuối cùng trước khi kết thúc thí nghiệm.
b. Các chỉ tiêu về giải phẫu
* Thu mẫu: lấy rễ của mạch môn ở phần rễ sơ cấp ñể tiến hành giải phẫu vào tháng 1 năm ñể 2013.
*Phương pháp cắt nhuộm:
• Cắt trực tiếp bằng tay với lưỡi lam
• Cắt xong sử dụng phương pháp nhuộm kép gồm các bước:
o Ngâm mẫu cắt trong dung dịch cồn 70 ñộ trong thời gian 24 giờ sau ñó rửa sạch với nước cất.
o Nhuộm ñỏ bằng dung dịch ñỏ carmin trong thời gian 12 giờ sau ñó rửa sạch với nước cất.
o Nhuộm xanh bằng dung dịch xanh metylen loãng trong khoảng 10-15 phút sau ñó rửa lại với nước cất.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 33
*Phương pháp ño trên kính hiển vi
Sử dụng phương pháp ño gián tiếp bằng cách so sánh kích thước của vật cần ño với một thước ño thị kính và thước ño vật kính ñược lắp thêm vào kính hiển vi.
Giá trị mỗi vạch trên trắc vi thị kính Ở vật kính 4: mỗi vạch tương ứng với 0,025 mm Ở vật kính 10: mỗi vạch tương ứng với 0,01 mm Ở vật kính 40: mỗi vạch tương ứng với 0,0025 mm * Sử dụng kính hiển vi nối với máy tính kĩ thuật số ñể chụp ảnh, ñếm số bó mạch trong rễ.
c. Các chỉ tiêu sinh lý của cây mạch môn
* ðo thế nước trong lá cây bằng máy ño PMS 610. Lấy mẫu lá vào 9 giờ
sáng.
* Xác ñịnh hàm lượng proline trong lá của các mẫu giống.
Hàm lượng proline ñược xác ñịnh theo phương pháp của Bates và cs. (1973).
• Chuẩn bị mẫu: mẫu lá lấy từ ruộng thí nghiệm vào lúc 8 giờ • Tiến hành:
o Nghiền 0,5 g mẫu lá trong 10 ml sulfosalicylic 3% sau ñó lọc qua giấy lọc, bỏ cặn.
o Hút 2ml dung dịch mẫu cho phản ứng với 2ml axit axetic glacial và 2ml ninhydrin, phản ứng ñược thực hiện ở 100 ñộ C trong 1 giờ (ñun cách thủy trên bếp ñiện). Kết thúc phản ứng, hỗn hợp
ñược làm lạnh trong khay ñá.
o Thêm vào hỗn hợp phản ứng 4ml toluene, trộn bằng máy lắc vortex trong 15-20 giây.
o Sau khi hỗn hợp phản ứng bị tách làm 2 pha, hút pha lỏng phía trên (có màu hồng nhạt) và ño ở bước sóng λ = 520 nm (dùng toluene làm bình blank).
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 34 • Phương trình ñường chuẩn: x = (y – 0,0827)/ 0,1962
Trong ñó: x là hàm lượng proline (µg/ml) y: giá trịñộ hấp thụ
• Hàm lượng proline ñược xác ñịnh theo công thức sau:
µg proline/ml x ml toluene x 5 µmol proline/ g mẫu tươi =
115,13 x g mẫu Trong ñó 115,13 là khối lượng phân tử của proline
*Xác ñịnh hàm lượng nước nước tự do trong rễ, củ, thân lá của các mẫu giống mạch. Hàm lượng nước tự do ñược tính theo công thức
• Lượng nước tự do (g) = A-B
• Hàm lượng nước tự do (%)= [(A-B)/A] x100 Trong ñó: A(g) khối lượng mẫu tươi,
B(g) khối lượng mẫu sau khi phơi ñến khối lượng không ñổi