2.2.1. XỬ LÝ NGUYÊN LIỆU
Lá Sen (loại bỏ cuống) được sấy ở 50 0C đến khi giòn, đem bóp vụn để đạt kích thước 1 – 3 mm.
Lá Chè xanh tươi được loại bỏ lá dập và rửa sạch. 2.2.2. KIỂM NGHIỆM NGUYÊN LIỆU
Lá Sen được kiểm nghiệm theo tiêu chuẩn DĐVN III về các chỉ tiêu: mô tả, vi phẫu, soi bột, độ ẩm, độ tro, tỷ lệ vụn nát, tạp chất, định tính và định lượng [5].
Chè xanh không có quy định trong DĐVN III nên được kiểm nghiệm với chỉ tiêu: mô tả, soi bột, vi phẫu và định tính tannin theo tiêu chuẩn tự xây dựng. 2.2.3. CHIẾT XUẤT
Các dược liệu sau khi đã xử lý, được chiết theo các quy trình sau:
Hình 2.3. Sơđồ quy trình chiết xuất dược liệu Chè xanh Lá Chè xanh Lá Chè xay nhỏ Dịch chiết cồn - Diệt men - Xay Đun hồi lưu với EtOH 50% - Lọc, cô giảm áp - Sấy chân không Cao Chè xanh
27
Hình 2.4. Sơ đồ quy trình chiết xuất dược liệu lá Sen 2.2.4. TIÊU CHUẨN HÓA CAO DƯỢC LIỆU
Các cao dược liệu được tiêu chuẩn hóa với các chỉ tiêu: - Độ tan trong nước
- Độ tan trong cồn cao độ - Độẩm
- Tro toàn phần
- Tro không tan trong acid hydrochloric - Định tính - Định lượng - Lọc, cô giảm áp - Sấy giảm áp Bột lá sen Dịch chiết cồn Đun hồi lưu với EtOH 15% Cao lá Sen
28
2.2.5. THỬ NGHIỆM ĐỘC TÍNH CẤP CỦA CÔNG THỨC PHỐI HỢP CAO DƯỢC LIỆU TRÊN CHUỘT [4,6]
Điều kiện thí nghiệm
Thuốc thử nghiệm: các bột cao được hòa vào trong nước cất.
Dụng cụ thí nghiệm: kim đầu tù cho chuột uống, dụng cụ mổ, dụng cụ pha thuốc.
Chuẩn bị động vật thí nghiệm: Chuột mua về được để ổn định trong khoảng thời gian 1 tuần, được cung cấp đầy đủ khẩu phần ăn và nước uống. Chuột phải nhịn đói 16 giờ trước thử nghiệm (chuột vẫn uống nước bình thường).
Đường dùng thuốc:đường uống.
Thể tích dùng thuốc: 10 ml/kg thể trọng.
Số lần dùng thuốc: dùng một lần duy nhất trong một ngày trong khoảng thời gian từ 8-9 giờ sáng.
Phương pháp thử
Việc thăm dò liều ban đầu được thực hiện qua 2 giai đoạn: - Giai đoạn thăm dò (mỗi lô dò liều gồm 6 chuột).
- Giai đoạn xác định.
Phải theo dõi các lô thật chặt chẽ trong 72 giờ đầu sau khi dùng thuốc. Sau đó nếu thấy cần thiết thì theo dõi trong suốt 2 tuần tiếp theo.
Thử nghiệm sơ khởi
Dùng 6 con chuột với 1 liều bất kỳ, với thể tích tối đa là 10 ml/kg chuột. Nếu kết quả chết cả 6 con thì thăm dò với 6 con khác với liều giảm một nữa. Nếu
29
cả 6 con đều sống thì cũng thăm dò với 6 con khác nhưng với liều tăng lên gấp đôi.
Thăm dò như vậy cho đến khi tìm được một liều làm chết 50% con vật thì lấy liều đó làm liều cơ sở, rồi dùng một số liều lớn hơn theo bước nhảy liều cho đến một liều làm chết tất cả các con vật thử nghiệm, và dùng một số liều nhỏ hơn theo bước nhảy liều cho đến khi thấy một liều làm tất cả các con vật đều sống. Từđó, ta sẽ tìm được: Liều tối đa dung nạp: không có thú vật chết (d1). Liều tối thiểu làm chết tất cả thú vật thử nghiệm (d2). (d1), (d2) là giới hạn khoảng cách mà từ đó ta phải tìm những liều để thử nghiệm xác định. Thử nghiệm xác định
Dùng khoảng 6 lô, mỗi lô 10 chuột. Ở những liều gần LD50 nên gia tăng số lượng súc vật đểđo lường được chính xác hơn.
Quan sát súc vật trong 72 giờ sau khi dùng thuốc để ghi nhận số súc vật chết, sống trong mỗi lô và tiếp tục theo dõi trong suốt hai tuần tiếp theo.
Chỉ tiêu đánh giá kết quả
Theo dõi kỹ trong thời gian 72 giờ sau khi dùng thuốc. Sau đó, theo dõi thêm 2 tuần tiếp theo và ghi chép đầy đủ chi tiết mỗi diễn biến. Ghi giờ cho uống thuốc, giờ xuất hiện các triệu chứng khác thường, giờ chuột chết (nếu có) và tình trạng ngộđộc trước khi chuột thí nghiệm chết.
30
Bảng 2.1. Các hành vi của chuột cần chú ý trong thời gian theo dõi
Hệ thống cơ quan Quan sát và thử nghiệm Dấu hiệu chung của độc tính Hành vi Hung hăng, phát âm khó khăn, bồn chồn, tê dại Vận động Co giật, tê liệt, run, mất điều hòa, sự giảm trương lực cơ, liệt cơ, tăng co thắt cơ Hệ thống thần kinh trung ươngvàhệ thần kinh vận động Phản ứng lại các kích thích khác Dễ kích thích, thụ động, mất cảm giác (gây tê, mê), tăng cảm giác Phản ứng não và tuỷ sống Chậm chạp, lờ đờ, mất cảm giác Trương lực cơ Co cứng hay mềm nhũn. Kích thước đồng tử Giãn đồng tử, co đồng tử. Hệ thần kinh thực vật
Lỗ mũi Chảy nước mũi (có màu hay không) Hệ hô hấp Đặc tính và tốc độ Nhịp thở chậm, khó thở Hệ tim mạch Dấu hiệu của tim mạch Hồi hộp, rung động, nhịp tim chậm, loạn nhịp tim, nhịp đập nhanh hơn hoặc yếu hơn
31
Các triệu chứng Tiêu chảy, táo bón
Hình dáng bụng Đầy hơi, teo ruột, tăng co bóp. Dạ dày ruột Độ chắc và màu sắc của phân Không điển hình hoặc phân đen. Âm hộ và tuyến vú Sưng tấy Cơ quan sinh dục Dương vật Sa xuống
Da và lông Màu, tình trạng Ửng đỏ, phát ban, da nhăn nheo, xù lông Màng nhầy Màng kết, miệng Tiết dịch, xung huyết, xuất huyết, chứng xanh xám, bệnh vàng da. Mi mắt Sa mí mắt Nhãn cầu Lồi nhãn cầu, co giật nhãn cầu Mắt Tính trong suốt Bị mờ đục
Ghi nhận số súc vật chết trong từng lô, lập bảng phân suất tử vong.
Xét nghiệm đại thể ngay sau khi chết đối với chuột bị chết và làm xét nghiệm đại thể sau khi kết thúc thử nghiệm đối với súc vật còn sống. Xác định LD50
32
2.2.6. THỬ NGHIỆM TÁC DỤNG GIẢM CÂN CỦA CÔNG THỨC PHỐI HỢP CAO DƯỢC LIỆU TRÊN CHUỘT [21]
Nguyên tắc
Trộn cao dược liệu vào thức ăn gây tăng cân, theo dõi tác dụng giảm cân qua việc xác định khối lượng chuột và thức ăn đưa vào trong thời gian 9 tuần
Thành phần thức ăn cho chuột Bảng 2.2. Thành phần của 100 g thức ăn chuột Thức ăn béo (HF) CT a CT b HF + Orlistat 0,012% Mỡ bò Đường Tinh bột bắp Vitamin + khoáng chất Cao Chè xanh Cao lá Sen Orlistat Casein 40 9 10 5 0 0 0 36 40 9 10 5 1,5 1,5 0 33 40 9 10 5 2,5 2,5 0 31 40 9 10 5 0 0 0,012 36 CT a: HF + 3% cao dược liệu (cao Chè xanh : cao lá Sen = 1:1)
33
Đánh giá kết quả
Các số liệu được trình bày dưới dạng: TB ± SEM. Sử dụng phần mềm thống kê SPSS ver. 13 để thống kê các số liệu. Phân tích các số liệu bằng phép kiểm Kolmogorov-Smirnov cho thấy có sự phân bố không bình thường ở một số dãy số liệu. Do đó, việc thống kê trong đề tài này sử dụng phép kiểm Kruskal- Wallis, tiếp theo là phép kiểm Mann-Whitney U test để so sánh sự khác biệt giữa các lô. Sự khác nhau được xem là có ý nghĩa khi giá trị p<0,05.
2.2.7. THỬ NGHIỆM ĐỘC TÍNH BÁN TRƯỜNG DIỄN
Điều kiện thí nghiệm
Thuốc thử nghiệm: bột cao được hòa vào trong nước cất.
Dụng cụ thí nghiệm: kim đầu tù để cho uống, dụng cụ mổ, dụng cụ pha thuốc. Động vật thí nghiệm: Chuột mua vềđược đểổn định trong khoảng thời gian 1 tuần, được cung cấp đầy đủ khẩu phần ăn và nước uống.
Đường dùng thuốc: đường uống
Thể tích dùng thuốc: 10 ml/kg thể trọng.
Liều dùng thuốc: 0,6 g/kg chuột (bằng 1/10 liều tối đa trong thử nghiệm độc tính cấp đường uống).
Số lần dùng thuốc: dùng một lần duy nhất trong một ngày trong khoảng thời gian từ 8-9 giờ sáng.
Phương pháp thử nghiệm
Chuột thử nghiệm được chia ngẫu nhiên thành 2 lô: Số lô chuột trong thử nghiệm độc tính bán trường diễn
34
Lô Số chuột Thuốc uống Liều
Chứng 40 Nước cất 10 ml/kg chuột
Thử 40 Cao dược liệu Chè xanh : Lá sen (1:1)
0,6 g/kg chuột
Thời gian nuôi: 60 ngày
Chuột ở cả hai lô được nuôi dưỡng trong cùng điều kiện và cùng chế độ dinh dưỡng.
Theo dõi và đánh giá kết quả
Chuột được cho uống thuốc 1 lần mỗi ngày vào buổi sáng, đưa thẳng thuốc vào dạ dày chuột bằng bơm tiêm có đầu tù. Trong thời gian thử nghiệm, theo dõi tình trạng chung của chuột về thể trọng, mức tiêu thụ thức ăn, khả năng hoạt động, tình trạng phân, nước tiểu, lông…
Sau thời gian thử nghiệm, chuột ở tất cả các lô được lấy máu để làm xét nghiệm, các mẫu máu được chia làm 2 loại:
- Mẫu máu đựng trong ống có chứa EDTA tránh đông được giữ lạnh để làm xét nghiệm công thức máu như: số lượng hồng cầu, số lượng bạch cầu, số lượng tiểu cầu, hematocrit… tại phòng xét nghiệm huyết học, Bệnh viện Chợ Rẫy, TP. Hồ Chí Minh trên máy phân tích huyết học tự động Excell 22 (Drew- Mỹ).
- Mẫu máu đựng trong ống không có EDTA được dùng làm xét nghiệm xác định các thông số thuộc chức năng của gan, thận tại phòng xét nghiệm sinh
35
hóa, Bệnh viện Chợ Rẫy, TP. Hồ Chí Minh trên máy xét nghiệm sinh hoá Hitachi 717, thuốc thử của hãng Prolabo (Pháp).
Sau khi lấy máu, chuột được mổ để quan sát đại thể và lấy nội tạng để quan sát vi thể. Gan và thận chuột được lấy một cách cẩn thận, tránh dập nát và được bảo quản ngay vào trong dung dịch formol 10% và được phân tích vi phẫu tại bộ môn Giải Phẫu, khoa Y, trường đại học Y - dược TP HCM.
Các thông số theo dõi
- Các thông số huyết học: số lượng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, hematocrit…
- Thông số thuộc chức năng gan: GPT, GOT, protein.
- Thông số thuộc chức năng thận: creatinin huyết, urea huyết.
36 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU 3.1.1. CHÈ XANH [1], [3] Mô tả Hình 3.1. Lá Chè xanh
Lá đơn, phiến lá hình trái xoan, đầu lá thuôn nhọn, gốc lá nhọn hay tù, mép lá răng cưa đều, gân lá lông chim, cuống lá ngắn, dài 4 – 10 cm, rộng 2 – 2,5 cm. Phiến lá lúc non có lông mịn, khi già thì dày, bóng.
Vi phẫu
Biểu bì trên không mang lỗ khí và thường không có lông, tế bào nhỏ, nhiều cạnh không đều. Biểu bì dưới mang lông và lỗ khí. Lông đơn bào dài, thành dày, đầu nhọn. Mô giậu có hai hàng tế bào. Trong mô mềm có rất nhiều tinh thể calci oxalat hình cầu gai, có thể cứng thành dày. Gân giữa có những thể cứng, nhiều tinh thể calci oxalat, bó libe - gỗ có một vòng sợi trụ bì bao bọc.
37
Hình 3.2. Vi phẫu phiến lá Chè xanh
1. Biểu bì trên 2. Mô mềm giậu 3. Gỗ 4. Libe
5. Vòng sợi trụ bì 6. Mô mềm 7. Thể cứng 8. Biểu bì dưới
Hình 3.3. Các thành phần trong vi phẫu phiến lá Chè xanh
A B C D E 3 1 6 2 4 5 7 8
38
A. Biểu bì trên với mô mềm giậu B. Biểu bì dưới có lông đơn bào C. Lỗ khí ở biểu bì dưới D. Bó libe - gỗ
E. Thể cứng và calci oxalat hình cầu gai
Soi bột
Mảnh biểu bì mang lỗ khí; cương thể vách dày trong suốt, hình dạng thay đổi; lông che chởđơn bào; tinh thể calci oxalat hình cầu gai; mảnh mạch vạch.
Hình 3.4. Các cấu tử soi bột lá Chè xanh A. Mảnh biểu bì mang lỗ khí B. Cương thể C. Calci oxalat hình cầu gai D. Mạch vạch
A B
39
Định tính
Lấy 5 g dược liệu, cắt nhỏ, cho vào bình nón 50 ml, thêm 30 ml nước nóng, đun trên bếp cách thủy sôi 10 phút, lắc đều khi đun. Lọc lấy dịch lọc trong dùng làm các phản ứng định tính sau:
Phản ứng với dung dịch protein
Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, cho thêm 1 giọt thuốc thử gelatin muối. Phản ứng dương tính nếu có tủa trắng đục. (+)
Phản ứng với muối kim loại nặng
Cho vào ống nghiệm 2 ml dịch chiết, thêm vào 1 giọt FeCl3 1%. Phản ứng dương tính khi có tạo tủa xanh rêu. (+)
Từ những kết quả nghiên cứu trên, tiêu chuẩn dược liệu lá Chè xanh được đề xuất như sau:
40
Bảng 3.1. Dự thảo tiêu chuẩn lá Chè xanh
STT Chỉ tiêu Mức chất lượng
1. Mô tả Lá đơn, phiến lá hình trái xoan, đầu lá thuôn nhọn, gốc lá nhọn hay tù, mép lá răng cưa đều, gân lá lông chim, cuống lá ngắn, dài 4 – 10 cm, rộng 2 – 2,5 cm. Phiến lá lúc non có lông mịn, khi già thì dày, bóng.
2. Vi phẫu Biểu bì trên không mang lỗ khí và thường không có lông, tế bào nhỏ, nhiều cạnh không đều. Biểu bì dưới mang lông và lỗ khí. Lông đơn bào, dài, thành dày, đầu nhọn. Mô giậu có hai hàng tế bào. Tinh thể calci oxalat hình cầu gai, thể cứng thành dày. Gân giữa có thể cứng, tinh thể calci oxalat, bó libe - gỗ có một vòng sợi trụ bì bao bọc.
3. Soi bột Mảnh biểu bì mang lỗ khí; cương thể vách dày trong suốt, hình dạng thay đổi; lông che chở đơn bào; tinh thể calci oxalat hình cầu gai; mảnh mạch vạch. Định tính: Phản ứng với TT gelatin muối Có tủa trắng đục 4. Phản ứng TT FeCl3 1%. Có tủa xanh rêu
41
3.1.2. LÁ SEN [5], [9]
Mô tả
Hình 3.5. Lá Sen khô
Lá nguyên tròn, nhăn nheo, nhàu nát, đường kính 30 – 60 cm. Mặt trên màu lục tro hơi nhám, mặt dưới màu lục nâu, nhẵn bóng, mép nguyên, ở giữa có vết tích của cuống lá lồi lên, màu nâu. Lá có từ 17 – 23 gân tỏa tròn, hình nan hoa, gân lồi về phía mặt dưới của lá. Lá giòn, dễ vụn nát, có mùi thơm.
Vi phẫu
Biểu bì trên gồm một lớp tế bào hình chữ nhật nhỏ, mặt ngoài có núm lồi, biểu bì dưới có tầng cutin dày. Mô mềm giậu có một lớp tế bào xếp sát biểu bì trên, chạy từ phiến lá qua gân lá. Mô dày ở gân lá cấu tạo bởi tế bào màng hơi dày, xếp thành đám, sát biểu bì dưới. Tế bào mô mềm có màng mỏng, xen kẽ giữa những tế bào mô mềm có nhiều khuyết to, kích thước không đều, xung quanh mỗi khuyết có nhiều tinh thể calci oxalat hình cầu gai. Có nhiều bó libe - gỗ kích thước khác nhau. Ở giữa gân có hai bó libe - gỗ to, những bó libe - gỗ nhỏ xếp rải rác xung quanh. Mỗi bó libe - gỗ có vòng mô cứng bao bọc, gỗ phía trên, libe ở dưới.
1
5 2
4
42
Hình 3.6. Vi phẫu lá Sen.
1. Biểu bì trên 2. Mô dày 3. Khuyết 4. Bó libe-gỗ nhỏ 5. Gỗ 6. Libe 7. Vòng mô cứng 8. Biểu bì dưới
Hình 3.7. Các thành phần trong vi phẫu lá Sen
A. Biểu bì dưới có tầng cutin dày B. Biểu bì trên của lá Sen
A B
43
C. Mô mềm giậu có chứa diệp lục D. Khuyết có chứa calci oxalate
Soi bột
Mảnh biểu bì trên gồm nhiều tế bào hình nhiều cạnh, kích thước không đều, màng ít ngoằn ngoèo, có lỗ khí ở dạng biến thiên. Màng phía ngoài biểu bì có nhiều núm lồi lên. Núm nhìn phía dưới mặt là những vòng tròn nhỏ, rải rác. Có những núm bị tách khỏi biểu bì hình 3 cạnh hay hình chuông. Mảnh biểu bì dưới gồm nhiều tế bào hình ngoằn ngoèo. Sợi màng hơi dày, có khoang rộng, có mảnh mạch mạng, mạch xoắn, tinh thể calci oxalat hình cầu gai.
Hình 3.8. Các cấu tử soi bột lá Sen
A. Biểu bì trên có núm lồi B. Mảnh biểu bì dưới C. Mạch xoắn D. Calcioxalat hình cầu gai E. Lông che chởđơn bào
Độẩm
Tiến hành theo DĐVN III, phụ lục 9.6, PL – 143.
A B C
44
Yêu cầu: Không quá 13%.
Bảng 3.2. Độẩm của lá Sen STT Độẩm (%) Trung bình (%) 1. 12,11 2. 11,05 3. 11,85 11,6
Kết luận: Đạt tiêu chuẩn DĐVN III.