Giải trình tự hiện đại áp dụng các chiến thuật giải trình tự trên quy mô lớn, có thể giải toàn bộ nhiễm sắc thể thay vì chỉ từng đoạn 300-1000 nucleodtide như trước đây. Mặt khác, những nhân tố khác đòi hỏi các phương pháp mới cần đáp ứng là nhanh, tiết kiệm chi phí, chính xác và tự động hóa.
Bên cạnh kỹ thuật sử dụng các gel để phân ly các phân tử DNA có độ dài khác nhau, các kỹ thuật mới liên quan đến phát hiện huỳnh quang của các nucleotide được đánh dấu, phân tích trình tự DNA bằng khối phổ, điện di mao quản hoặc lai với các đoạn oligonucleotide được tổng hợp nhân tạo. Những tiến bộ nhanh chóng trong lĩnh vực kính hiển vi điện tử cho phép quan sát chi tiết cấu trúc bề mặt của phân tử nucleic acid và phân biệt từng nucleotide. Ngoài ra, kỹ thuật lai sử dụng tấm chip gắn cố định các oligonucleotide cho phép phân biệt được hơn 50.000 phân tử DNA khác nhau. Trong tương lai gần, kỹ thuật lai này có thể gắn hàng nghìn oligo trên một tấm chip nhỏ và trình tự nucleotide được phân tích tự động bằng các chương trình của máy tính. Điều đó cho phép xác định trình tự một cách nhanh chóng.
Trên các máy đọc tự động hiện đại, thông thường bốn loại nucleotide được đánh dấu bằng các chất phát huỳnh quang khác nhau. Đầu đọc laser trong máy sẽ kích hoạt các chất này khiến chúng hấp thụ và phát ra các màu, mỗi màu ứng với một loại nucleotide và được hiển thị bằng một đỉnh. Thông thường, phản ứng gắn nucleotide vào sợi DNA tổng hợp trên sợi khuôn mẫu được thực hiện bằng PCR. Hai loại nucleotide dGTP và dTTP được thay thế bằng dITP và dUTP nhằm hạn chế sự trùng lặp các đỉnh. Sản phẩm PCR thường được tinh sạch, loại bỏ các nucleotide và primer thừa trước khi đưa vào máy đọc tự động. Trình tự đọc được trên máy tự động thường dài khoảng 600-1.000 bp. Ưu điểm của phương pháp này là kết quả đọc được đưa trực tiếp vào chương trình máy tính, giảm bớt sai sót do đọc bằng mắt gây ra. Hơn nữa, phản ứng PCR không đòi hỏi lượng DNA khuôn mẫu (dạng sợi đôi) nhiều nhưng các sợi đơn DNA cần đọc lại được khuếch đại lên rất nhiều lần.
Trình tự hệ gen cũng như các loại DNA được xác định ngày càng nhiều ở các sinh vật khác nhau. Do đó, việc lưu trữ số liệu, phân tích, so sánh và sắp xếp chúng đã thúc đẩy hình thành một hướng nghiên cứu mới đó là tin sinh học (bioinformatics). Mối liên quan mật thiết giữa trình tự nucleotide và protein đã khiến lĩnh vực mới này phát triển rất nhanh chóng. Ba ngân hàng dữ liệu chính hiện nay lưu trữ hầu hết các thông tin về DNA là EMBL (thuộc European Informatics Institute), GenBank (thuộc
US National Centre for Biotechnology Information) và DDBJ (thuộc DNA Database Bank of Japan). Một ngân hàng dữ liệu khác lưu trữ thông tin về protein là Swiss Protein Database (Thụy Sĩ).
4. Ứng dụng
Giải trình tự mở ra các hướng đi mới trong nghiên cứu các quá trình sinh học, phân loại sinh vật cũng như ứng dụng trong chuẩn đoán bệnh và phân tích pháp y.