Có 3 giai đoạn chính trong phản ứng PCR và chúng được lặp đi lặp lại nhiều lần (chu kỳ) (thường từ 25 đến 75 chu kỳ).
2.1. Giai đoạn biến tính (denaturation)
Trong giai đoạn này phân tử DNA mẫu bị biến tính ở nhiệt độ cao (thường là từ 94-95 oC, lớn hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử) trong vòng 30 giây đến 1 phút, tất cả các liên kết hydro giữ hai mạch của phân tử bị bẻ gãy và tạo thành các DNA sợi đơn.
2.2. Giai đoạn lai (hay bắt cặp) (hybridization)
Nhiệt độ được hạ thấp ( thường từ 40-70 oC, thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của mồi được sử dụng khoảng từ 3-5 oC) cho phép các mồi bám vào các phân tử DNA sợi đơn, đánh dấu phần DNA cần được khuyếch đại. Giai đoạn này kéo dài từ 30 giây đến một phút (còn được gọi là giai đoạn ủ).
Nếu nhiệt độ quá thấp thì các mồi sẽ gây nên nhiều lỗi và kết quả là sẽ tạo nên nhiều sản phẩm phụ. Nếu nhiệt độ quá cao thì phản ứng sẽ không có kết quả. Công thức để xác định nhiệt độ nóng chảy (Tm) một cách tương đối là Tm=4(G+C) + 2(A+T).
2.3. Giai đoạn kéo dài (elongation)
Nhiệt độ được tăng lên đến 72oC giúp cho DNA polymerase xúc tác tổng hợp DNA tốt nhất. Công việc của DNA polymerase là di chuyển dọc theo DNA sợi đơn và sử dụng nó làm khuôn để tổng hợp sợi DNA mới bổ sung với DNA mẫu bằng cách kéo dài các phần đã được đánh dấu bởi các mồi. Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào kích thước của DNA mẫu, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút.
Ở giai đoạn này của chu kỳ cuối cùng, thời gian được tăng thêm vài phút để các sợi DNA chưa được sao chép xong hoàn thành qúa trình tổng hợp. Sau mỗi chu kỳ, số bản sao của DNA mẫu lại được tăng gấp đôi. Đây là sự nhân bản theo cấp số nhân.
Như vậy cứ 1 phân tử DNA mẫu, sau phản ứng PCR với n chu kỳ sẽ tạo thành 2n bản sao phân tử DNA.
Ưu điểm của phương pháp PCR là chỉ cần một thời gian ngắn đã cho một số lượng DNA theo mong muốn. Sản phẩm của phản ứng PCR được phân tách trên gel agarose đã nhuộm ethimidium bromide và quan sát dưới máy chiếu tia UV.
Phương pháp RT-PCR: Taq-polymerase không có hoạt tính với RNA vì vậy phản ứng PCR không thể sử dụng để khuyếch đại RNA một cách trực tiếp. Tuy nhiên có thể sử dụng kết hợp enzyme sao chép ngược (reverse transcriptase-RT) với PCR để khuyếch đại RNA. Phản ứng này sử dụng khả năng của enzyme sao chép ngược để sao chép RNA thành DNA bổ sung sợi đơn và từ DNA bổ sung sợi đơn thành DNA bổ sung sợi kép. Sau đó DNA bổ sung sợi kép sẽ được khuyếch đại nhờ Taq-polymerase.
Sản phẩm của phản ứng RT-PCR là các phân tử DNA sợi kép tương ứng với phân tử RNA khuôn mẫu. RNA tế bào tổng số tách chiết từ mô hoặc tế bào được sử dụng làm khuôn mẫu cho phản ứng sao chép ngược. Ưu điểm của phương pháp này là cho phép nghiên cứu các mRNA với hàm lượng rất thấp mà các phương pháp như Northern blot... không thể thực hiện được.