Các phương pháp xác định trình tự nucleotide cổ điển có thể chia thành hai nhóm: phương pháp hóa học của Allan Maxam và Walter Gilbert và phương pháp sinh tổng hợp của Frederick Sanger
Trong khi phương pháp Maxam-Gilbert sử dụng việc đánh dấu hóa học đặc hiệu các nucleotide, phương pháp dideoxy của Sanger làm dừng một cách đặc hiệu sự tổng hợp DNA bằng DNA-polymerase nhờ sử dụng các dideoxynucletiode. Do thao tác đơn giản và các nguyên liệu được thương mại hóa dưới dạng các bộ chế sẵn (kit) nên gần đây hầu như để xác định trình tự nucleotide người ta chỉ sử dụng phương pháp dideoxy. Còn phương pháp Maxam-Gilbert như là phương pháp kiểm chứng sự nối dài primer, S1 mapping và xác định trình tự nucleotide đoạn đặc hiệu tương đối ngắn. Trong cả hai phương pháp, người ta đều cần cắt ngắn các đoạn DNA vừa phải để giải trình tự dần. Từ kết quả các đoạn DNA sau một loạt lần giải trình tự người ta có thể ghép nối để có trình tự nucleotide hoàn chỉnh
Nguyên tắc cơ bản của phương pháp Dideoxy dựa vào hoạt động của enzyme DNA polymerase trong quá trình tổng hợp DNA. Enzyme DNA polymerase xúc tác
gắn các nucleotide vào mạch đơn DNA đang tổng hợp ở vị trí 3' có chứa nhóm OH tự do, khi gặp nucleotide không có nhóm 3'-OH thì phản ứng tổng hợp bị dừng lại. Đặc trưng của phương pháp là sử dụng dideoxynucleotide để làm ngừng phản ứng tổng hợp DNA một cách ngẫu nhiên. Trong phản ứng sử dụng đoạn DNA mồi là đoạn DNA mạch đơn có kích thước 20 nucleotide.
Phương pháp được chia làm 4 phản ứng thực hiện riêng rẽ có DNA khuôn, DNA mồi, đầy đủ các loại dNTP (deoxynucleotide), enzyme Taq polymerase, dung dịch đệm và các điều kiện phản ứng thích hợp đồng thời có bổ sung thêm khoảng 1% một loại ddNTP (dideoxynucleotide) cho mỗi phản ứng khác nhau. Các dideoxynucleotide bị mất 2 nguyên tử oxy ở carbon thứ 3 và carbon thứ 4. Do đó khi mạch DNA đang tổng hợp bị gắn 1 ddNTP thì không có nhóm 3'-OH ở nucleotide cuối cùng nên mạch đang tổng hợp không được kéo dài tiếp tục phản ứng tổng hợp sẽ dừng lại.
Chính do lượng ddNTP được đưa vào với một lượng nhỏ so với lượng dNTP nên thỉnh thoảng mới có một ddNTP được sử dụng ngẫu nhiên làm phản ứng tổng hợp DNA dừng lại. Kết quả sẽ tổng hợp được các đoạn nucleotide có kích thước dài ngắn khác nhau. Để xác định trình tự, người ta điện di kết quả thu được trên gel polyacrylamid. Các đoạn oligonucleotide có kích thước khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau trên bản gel. Lúc này thực hiện phản ứng hiện hình phóng xạ có thể quan sát được các đoạn mạch đơn DNA bằng các vạch trên bản gel. Tổng hợp kết quả sẽ thu được trình tự sắp xếp các nucleotide của đoạn gen.