2.1.2. Địa điểm nghiên cứu
- Thu mẫu tôm ở hệ thống nuôi đa cấp tại Trung Tâm nghiên cứu Hải sản nước lợ Tân Thành - Dương Kinh - Hải Phòng.
- Phân tích mẫu tại Phòng Sinh học Thực nghiệm - Viện nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản I - Đình Bảng - Từ Sơn - Bắc Ninh.
2.2. Vật liệu nghiên cứu:
Tôm sú (Penaeus monodon).
2.3. Phương pháp nghiên cứu
Dựa vào phương pháp nghiên cứu bệnh vi khuẩn ở cá và động vật thuỷ sản của Frerichs và Millar (1993), Nicky B. Buller (2004).
Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu phân lập vi khuẩn
Mẫu tôm
Nuôi cấy, phân lập
Nhuộm Gram
Phân loại vi khuẩn
Thử các phản ứng sinh hoá Hình thái khuẩn lạc
2.3.1. Phương pháp thu mẫu và xử lý mẫu
- Sử dụng vó đặt ở các điểm khác nhau trong ao để thu tôm nhằm đảm bảo tính đại diện của mẫu.
- Cho tôm vào túi nilon có bơm oxy, ghi rõ nhãn tôm thu từ các mô hình nào trong hệ thống đa cấp và vận chuyển về phòng thí nghiệm. Sau khi chuyển về phòng thí nghiệm, mẫu tôm được phân tích trong vòng 24h kể từ lúc có mẫu. Yêu cầu tất cả các dụng cụ chứa mẫu phải khô, sạch, đã được khử trùng, và kín để tránh sự lây nhiễm làm hư hỏng mẫu trong quá trình vận chuyển.
- Số mẫu tôm: Mỗi mô hình nuôi thu 25 mẫu, định kỳ 30 ngày thu 1 lần. - Tách lấy gan tụy của tôm đem nuôi cấy, phân lập.
2.3.2. Phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn
* Nuôi cấy vi khuẩn:
- Chuẩn bị 4 ống nghiệm, mỗi ống cho 9ml nước muối 2%.
- Thực hiện việc đồng nhất mẫu: Dùng bộ đồ giải phẫu đã được khử trùng, tách lấy gan tụy của tôm để cân và cho vào cối sứ, dùng chày nghiền nhỏ mẫu, có thể cho thêm 1 - 2 ml nước muối 2% để nghiền.
- Pha loãng mẫu theo dãy số thập phân bằng cách dùng pipet vô trùng (hoặc pipetman với đầu tip vô trùng) chuyển 1ml dịch mẫu vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối 2%. Trộn mẫu trong ống nghiệm cho đồng nhất bằng máy rung (vortex) hoặc dùng pipet hút đảo dịch mẫu lên xuống 5 - 10 lần. Dung dịch mẫu này có độ pha loãng 10-2. Sau đó, sử dụng cùng pipet hoặc pipetmen có cùng đầu tip chuyển 1ml dịch mẫu này vào ống nghiệm thứ hai chứa 9ml dung dịch pha loãng và thao tác tương tự để có dịch mẫu với độ pha loãng 10-3, 104, 105.
- Dùng pipet hút 0,1 ml dung dịch đã được pha loãng trang trên đĩa môi trường TCBS, mỗi hệ số pha loãng cấy trên 2 đĩa.
- Sau 24h, kiểm tra hình dạng, màu sắc, kích thước và đếm số lượng kl. * Định lượng vi khuẩn:
- Dựa theo phương pháp định lượng vi khuẩn (đếm số khuẩn lạc trực tiếp trên môi trường nuôi cấy) của S.D Millar và G.N. Frerichs (1993).
- Tính số lượng vi khuẩn trong 1 gam tổ chức theo công thức dưới đây:
Trong đó:
A: Số khuẩn lạc mọc trên một đơn vị thể tích (kl/ml)
X: Số khuẩn lạc trung bình mọc trên đĩa môi trưòng khi cấy ở một hệ số pha loãng. V: Thể tích mẫu đã dùng để cấy (ml) K: Hệ số pha loãng * Xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Trong đó:
X (%): Tỷ lệ phần trăm tôm bị nhiễm. A: Số mẫu tôm bị nhiễm.
B: Số mẫu tôm kiểm tra. * Nuôi cấy thuần chủng:
- Mở đĩa phân lập có khuẩn lạc nghi ngờ bên cạnh ngọn lửa đèn cồn. - Dùng que cấy vô trùng lấy 1 khuẩn lạc nghi ngờ riêng rẽ.
- Cấy lên đĩa thạch Nu Agar 2% NaCl.
- Nuôi cấy trong tủ ấm ở nhiệt độ 28 - 300C trong 24h. * Phương pháp nghiên cứu hình thái vi khuẩn:
X = A B 100 x A(cfu/ml) = X.1 K.V
Để nghiên cứu hình thái vi khuẩn, người ta dùng phương pháp nhuộm gram. Nhuộm gram tiến hành như sau:
- Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn thuần đưa lên lam kính, cho thêm 1 đến 2 giọt nước muối sinh lý vô trùng, dùng đầu que cấy dàn mỏng.
- Để mẫu tự khô ở nhiệt độ phòng.
- Hơ cao lam kính trên ngọn lửa đèn cồn để cố định vi khuẩn.
- Nhỏ tiếp dung dịch 1 (tím tinh thể) lên tiêu bản, để yên 30-60 giây. - Rửa nước nhanh, vẩy khô.
- Nhỏ dung dịch 2 (Lugol) để cố định trong 1 phút (tiêu bản có màu đen). - Rửa nước nhanh, vẩy khô.
- Nhỏ dung dịch 3 (Cồn Aceton) để nghiêng đầu một bên lam để cồn chảy qua chỗ phết vi khuẩn, nhằm tẩy màu.
- Rửa nước nhanh, vẩy khô.
- Nhỏ dung dịch 4 (Safranin) để cố định 1 đến 2 phút.
- Rửa nước, để khô hoặc dùng giấy thấm khô, không được để xước mẫu. - Soi dưới kính hiển vi bằng vật kính dầu (độ phóng đại x1000).
Dưới kính hiển vi ta có thể xác định được vi khuẩn gram âm bắt màu hồng và gram dương bắt màu xanh tím.
* Phương pháp kiểm tra các đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn: - Thử đặc điểm sinh hóa bằng các phản ứng sinh hóa thường:
+ Thử phản ứng lên men và ôxy hóa của vi khuẩn bằng phản ứng O/F Cấy vi khuẩn thuần vào 2 ống nghiệm có môi trường O/F (màu xanh), một ống hở và một ống kín được phủ bằng dầu paraffin trên mặt dầy 1 cm. Nuôi vi khuẩn trong thời gian 18 - 24h ở nhiệt độ phòng, sau đó đọc kết quả:
Lên men: Ống hở và ống kín có màu vàng Oxy hóa: Ống hở màu vàng, ống kín màu xanh Không oxy hóa và lên men: Cả hai ống màu xanh. + Thử thạch sắt 3 đường (TSI)
Cấy vi khuẩn thuần trên bề mặt thạch nghiêng môi trường TSI hoặc KIA (màu đỏ) và từ giữa mặt thạch cấy một đường thẳng đứng xuống đáy. Nuôi cấy vi khuẩn sau 18 - 24 giờ ở nhiệt độ phòng, đọc kết quả:
Chỉ lên men đường Glucose: Đáy ống màu vàng (acid - A); phần nghiêng màu đỏ (kiềm - K) K/A (đỏ/vàng)
Lên men cả 3 đường glucose, lactose và sucrose: Đáy và phần nghiêng đều màu vàng (acid - A) A/A (vàng/vàng)
Lên men đường lactose hoặc sucrose: Phần nghiêng màu vàng (acid), đáy ống màu đỏ (kiềm) A/K (vàng/đỏ)
Không lên men cả 3 loại đường: Đáy và phần nghiêng màu đỏ (kiềm) K/K (đỏ/đỏ)
Môi trường rạn nứt là sinh hơi Đáy ống có màu đen là sinh H2S + Phản ứng indol
Cấy vi khuẩn thuần trong nước tryptone, nuôi cấy vi khuẩn trong 24 - 48 giờ ở nhiệt độ phòng. Nhỏ 0,2 - 0,3 ml thuốc thử Kovac’s vào 5ml môi trường đã nuôi cấy vi khuẩn, đọc kết quả:
Bề mặt môi trường có vòng màu đỏ là vi khuẩn sinh indol - dương tính Môi trường có màu vàng là vi khuẩn không sinh indol - âm tính.
+ Phản ứng sinh H2S
Cấy vi khuẩn thuần trong môi trường SIM trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng, xuất hiện màu đen ở dọc đường cấy là có phản ứng sinh H2S.
+ Phép thử khả năng chịu mặn
Chuẩn bị một dãy các dung dịch pepton với nồng độ muối natri clorua (NaCl) tăng dần: 0%, 3%, 7% và 10%.
Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn thuần và cấy nhẹ vào mỗi ống (bằng một vòng cấy đầy). Ủ ở 37oC trong 24 ± 3h.
Nếu quan sát thấy đục, chứng tỏ vi khuẩn nghi ngờ có thể phát triển với nồng độ muối Natri clorua có mặt trong ống đựng nước pepton muối.
- Thử phản ứng sinh hoá bằng kít thử API - 20 E:
Khi được vi khuẩn thuần, tiến hành pha loãng vi khuẩn thành dung dịch ở dạng huyền phù để thử phản ứng sinh hoá.
Nguyên lý
Phương pháp này dùng 21 tiêu chuẩn thử sinh hóa cho phép định tên một số loài vi khuẩn hình que, gram âm và thuộc họ Enterobacteriaceae.
Kít thử API 20E gồm có các ống nghiệm nhỏ (microtube) trong có chứa các chất nền đã khử nước. Trong quá trình ủ, hoạt động của vi khuẩn sẽ làm chuyển màu hoặc làm đục môi trường. Sau 24h đọc các phản ứng đối chiếu theo bảng kết quả để định tên.
Chuẩn bị kit
+ Chuẩn bị hộp ủ và đổ 5ml nước cất (hoặc nước khử khoáng) vào chỗ lõm để tạo hơi ẩm
Chuẩn bị mẫu
+ Kít thử API 20E không dùng trực tiếp các mẫu bệnh phẩm
OF-F OF-O ONPG ADH LDC OCD CIT H2S URE TDA IND VP GEL GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA
Qui trình thử kít API 20E
1 2
3 4
+ Thu mẫu bệnh phẩm, cấy lên môi trường chọn lọc. Sau đó tiến hành chọn khuẩn lạc để nuôi thuần; sau 24 giờ nuôi cấy, lấy vi khuẩn thuần để pha loãng thành dịch huyền phù bằng 5ml NaCl 2%.
Chuẩn bị ủ
+ Dùng một pipet lấy dịch huyền phù vi khuẩn cho đầy vào các ống. + Đổ 1 lớp dầu vào các ống ADH, LDC, ODC, H2S, URE, VP và GEL để tạo môi trường yếm khí.
+ Thử thêm ngoài trên 2 ống O/F
Ủ mẫu
+ Ủ các mẫu phản ứng đó ở nhiệt độ 27 - 290C thời gian 24 - 48h.
Đọc kết quả
Đọc kết quả theo bảng đọc và dùng các thuốc thử hiển thị kết quả: + Thử TDA: Cho 1 giọt thuốc thử TDA chuyển màu nâu đỏ là dương tính. + Thử IND: Cho 1 giọt thuốc thử JAMES phát triển màu hồng trong ống thử là dương tính.
+ Thử VP: Cho 1 giọt thuốc thử VP 1 và 1 giọt thuốc thử VP 2, đợi ít nhất 10 phút chuyển màu hồng hoặc đỏ là dương tính. Nếu chuyển màu hồng nhẹ sau 10 phút là âm tính.
+ Thử NO2: Cho 1 giọt NIT 1 và 1 giọt NIT 2 vào ống GLU. Đợi sau 2 - 5 phút chuyển màu đỏ là dương tính. Chuyển màu vàng có thể chúng khử đến N2 (1 số trường hợp sinh hơi ở đáy) cho thêm 2-3mg Zn vào ống GLU. Sau 5 phút nếu ống chuyển lại màu vàng là phản ứng sinh khí N2 là dương tính; nếu ống chuyển màu da cam đến đỏ là âm tính.
+ Đối với môi trường OF: Dùng que cấy đã được hơ nóng và để nguội, lấy vi khuẩn và chọc thẳng vào ống nghiệm chứa môi trường OF, nuôi trong tủ ấm 24 giờ và đọc kết quả.
* Phân loại vi khuẩn:
- Theo tiêu chuẩn chung; đi từ họ, giống đến tiêu chuẩn đặc trưng cho loài. - Dựa vào những đặc điểm và kết quả thử phản ứng sinh hoá, phân loại vi khuẩn dựa vào bảng phân loại vi khuẩn, cẩm nang phân loại vi khuẩn của Frerichs (1984) và Nicky B. Buller (2004).
2.4. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu
Số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm Exell. Sử dụng phương pháp phân tích phương sai ANOVA 1 nhân tố để phân tích và so sánh sự sai khác giữa các mô hình nuôi
PHẦN 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả về thành phần loài vi khuẩn Vibrio spp gây bệnh trên tôm ởcác mô hình nuôi. các mô hình nuôi.
Thành phần loài vi khuẩn Vibrio spp gây bệnh trên tôm ở các mô hình nuôi được giám định qua phản ứng sinh hóa sau:
Bảng 3.1. Đặc tính sinh hóa của Vibrio spp phân lập được
Đặc điểm sinh hóa Các loài phân lập được
Loài 1 Loài 2 Loài 3
Màu KL/TCBS Xanh nhạt Vàng Xanh
Nhuộm Gram - - - Hình dạng VK TK TK TK OF +/+ +/+ +/+ ONPG +(w) - - ADH - - - LDC - + + ODC + + + CIT +(w) + + H2S - - - URE - - - TDA - - + IND + + + VP - - - GEL + + + GLU + + + MAN + + + INO - - - SOR - - - RHA - - - SAC +(w) + - MEL - +(w) - AMY + + + ARA - +(w) +
Sinh trưởng trong nước pepton với:
= =
= =
0% NaCl 2% NaCl 6% NaCl 8% NaCl 10% NaCl - + + - - - + + + - - + + + -
Tên vi khuẩn V. harveyi V. alginolyticus V. parahaemolyticus
Ghi chú: “+”:Phản ứng dương tính “TK”:Trực khuẩn
“-”:Phản ứng âm tính “w”:phản ứng yếu
Đối chiếu với kết quả phản ứng sinh hóa API 20E của N.B. Buller (2004) [29], theo cục thuốc và thực phẩm Mỹ (2001) [6], chúng tôi nhận thấy có 90% các phản ứng sinh hóa của chủng 1 giống với V. harveyi, 85,7% các phản ứng sinh hóa của chủng 2 giống với V. alginolyticus và 90,5% các phản ứng của chủng 3 giống với V. parahaemolyticus. Như vậy, dựa vào hình thái, màu sắc của khuẩn lạc, hình thái vi khuẩn khi nhuộm Gram cùng với kết quả thử phản ứng sinh hoá có thể kết luận: Chủng vi khuẩn 1 là V. harveyi, chủng 2 là V. alginolyticus và chủng 3 là V. parahaemolyticus.
V. harveyi, V. alginolyticus và V. parahaemolyticus phát triển trên môi trường TCBS có khuẩn lạc tròn đều; V. harveyi khuẩn lạc màu xanh nhạt, đường kính từ 2 – 3mm. V. parahaemolyticus khuẩn lạc màu xanh, đường kính 3 - 5mm V. alginolyticus khuẩn lạc màu vàng, đường kính 2 - 3mm. Các vi khuẩn nhuộm Gram, bắt màu hồng (gram âm), hình dạng trực khuẩn. V. harveyi và V. alginolyticus đều có khả năng lên men đường saccarose, tuy nhiên V. harveyi phản ứng với saccarose và ONPG yếu hơn; ngoài ra còn có sự khác biệt về phản ứng LDC, MEL và ARA. V. parahaemolyticus không có khả năng sử dụng đường saccarose.
Khi thử khả năng sinh trưởng của 3 loài vi khuẩn trên trong môi trường pepton với nồng độ muối khác nhau thì thấy cả 3 loài đều không phát triển ở độ
muối 0%, riêng V. harveyi khả năng thích nghi với môi trường có độ muối thấp hơn; biểu hiện là chỉ phát triển được ở độ muối cao nhất là 6%, V. alginolyticus
và V. parahaemolyticus có khả năng phát triển tốt ở độ muối 8%.
3.2. Tỷ lệ nhiễm Vibrio spp trên tôm sú ở các mô hình nuôi.
3.2.1. Tỷ lệ nhiễm Vibrio spp trên tôm sú ở các mô hình trong tháng nuôi thứ 1
Hình 3.10. Biểu đồ tỷ lệ nhiễm Vibrio spp trên tôm sú ở các mô hình trong tháng nuôi thứ 1
Kết quả về tỷ lệ nhiễm Vibrio spp trên tôm sú ở các mô hình trong tháng nuôi thứ 1 cho thấy, ở các mô hình nuôi chỉ xuất hiện duy nhất 1 loài là V. alginolyticus, với tỷ lệ nhiễm từ 52,00 đến 56,00(%). Tỷ lệ nhiễm ở mô hình 2 cấp giảm so với mô hình 1 và mô hình 3. Tuy nhiên theo phân tích ANOVA thì tỷ lệ nhiễm loài này giữa 3 mô hình nuôi lại không có sự sai khác (p>0,05)
3.2.2. Tỷ lệ nhiễm Vibrio spp trên tôm sú ở các mô hình trong tháng nuôi thứ 2
Hình 3.11. Biểu đồ tỷ lệ nhiễm Vibrio spp trên tôm sú ở các mô hình trong tháng nuôi thứ 2
Thành phần loài Vibrio spp ở tháng nuôi thứ 2 nhiều hơn so với tháng nuôi thứ 1, đó là sự xuất hiện thêm của V. parahaemolyticus với tỷ lệ nhiễm dao động trong khoảng 10,67 - 28,00(%) còn V. alginolyticus là 53,33 - 72,00(%). Tỷ lệ nhiễm 2 loài này ở mô hình nuôi 1 cấp cao hơn so với mô hình nuôi 2 cấp và 3 cấp. Theo phân tích ANOVA thì tỷ lệ nhiễm cả hai loài này giữa 3 mô hình nuôi có sự sai khác có ý nghĩa thống kê (p<0,05).
3.2.3. Tỷ lệ nhiễm Vibrio spp trên tôm sú ở các mô hình trong tháng nuôi thứ 3
Hình 3.12. Biểu đồ tỷ lệ nhiễm Vibrio spp trên tôm sú ở các mô hình trong tháng nuôi thứ 3
Ở tháng nuôi thứ 3, thành phần loài Vibrio spp tiếp tục tăng, ngoài V. alginolyticus và V. parahaemolyticus còn có V. harveyi với tỷ lệ của các loài lần lượt là 52,00 - 84,00(%), 12,00 - 32,00(%) và 10,67 - 32,00(%). Tỷ lệ nhiễm của các loài này có xu hướng giảm dần theo cấp ao, cao nhất là ở mô hình nuôi 1 cấp sau đó đến mô hình nuôi 2 và 3 cấp. Khi phân tích ANOVA cho thấy tỷ lệ nhiễm cả 3 loài trên ở các mô hình nuôi đều có sự sai khác (p<0,05)
3.2.4. Tỷ lệ nhiễm Vibrio spp trên tôm sú ở các mô hình trong tháng nuôi thứ 4
Hình 3.13. Biểu đồ tỷ lệ nhiễm Vibrio spp trên tôm sú