Dịch chiết enzyme đã được loại bỏ phần lớn các protein tạp nhưng vẫn chưa
đảm bảo độ đồng nhất cần thiết. Do đó dịch chiết enzyme được tiếp tục làm sạch bằng phương pháp sắc ký cột.
- Phương pháp dùng chấ rây phân tử (lọc gel – gel filtration)
Cơ sở của phương pháp lọc gel là dựa vào sự khác nhau về kích thước hình dạng phân tử lượng của enzyme có trong hỗn hợp để tách chúng ra.
Đểđảm bảo cho việc tách enzyme được tốt, chất rây phân tử phải là chất trơ, không phản ứng với protein enzyme. Chất này cũng không hòa tan và tương đối bền với các yeus tố về cơ học cũng như sinh học. Ngoài ra chất được sử dụng cho mục đích lọc phân tử phải là chất không có tính đàn hồi (không co) và phải là chất
- Phương pháp sắc ký trao đổi ion
Phương pháp sắc ký trao đổi ion dựa vào sự khác nhau điện tích tổng số của các protein enzyme. Hay nói cách khác, phương pháp này dựa trên cơ sở của phản
ứng trao đổi ion giữa protein được tan trong nước hoặc dung dịch đệm loãng và các tác nhân trao dổi ion. Tác nhân (hay nguyên liệu) trao đổi ion có thể là chất nhựa có tích nhóm sinh ion hoặc là chất ionit. Đây là những chất giá trơ, không tan trong nước, có bản chát là cellulose hoặc chất gel dextran có lưới phân nhánh (Sephadex, Molselect) hoặc là chất nhựa polystiron. Chất giá thể này thường kết hợp với các nhóm ion hóa. Các chất trao dổi ion có chất giá là cellulose, sephadex, molselect thông thường được dùng để tách protein enzyme, còn các chất trao đổi ion có chất giá là polystirol (ví dụ như Dowex, Amberlite) chỉ dùng để tách các peptid có trọng lượng phân tử nhỏ hơn.
Anionit DEAE – cellulose (diethylamino – ethyl – cellulose) là dẫn xuất este của cellulose. C2H5
C2H5 Cellulose – O – CH2 – N