CHƯƠNG III CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY TẾ BÀO SÂM NGỌC LINH
3.3.1. Nguyên liệu:
Sử dụng các mô sẹo đã hình thành.
3.3.2. Môi trường:
Sử dụng môi trường nền MS. Ngoài ra còn bổ sung: 3.0 mg/l NNA.
Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh pH = 5.8. Môi trường được hấp khử trùng bằng autoclave ở nhiệt độ 1210C, áp suất 1atm.
3.3.3. Thiết bị và dụng cụ:
- Phòng chuẩn bị môi trường, khử trùng môi trường nuôi cấy, bảo quản dung dịch mẹ. Gồm có nồi hấp môi trường, tủ lạnh, bếp điện, cân phân tích, ống đong, pipet, máy đo pH.
- Phòng cấy vô trùng gồm tủ cây, đèn UV, các dụng cụ đã hấp vô trùng. - Phòng lạnh để nuôi cấy gồm kệ sắt, đèn chiếu sáng, nhiệt kế, máy điều hòa. - Các dụng cụ gồm đèn cồn, đĩa, dao cắt mẫu, kéo, bông gòn, chai ống nghiệm vô trùng loại 250 ml, 500 ml, giấy vô trùng, giây thun.
3.3.4. Hóa chất:
- Cồn 960, 700. - Nước cất vô trùng. - Dung dịch javel.
3.3.5. Qui trình thực hiện
- Khử trùng dụng cụ.
- Cắt nhỏ mô sẹo khoảng 0.5*0.5 cm đặt vào môi trường.
- Đậy nắp, bao gói ghi tên môi trường, mẫu cấy, ngày tháng, đem vào phòng nuôi.
3.3.6. Điều kiện nuôi cấy:
- Nhiệt độ: 25 ± 20C.
- Cường độ chiếu sáng: 2500- 3000 lux. - Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ ngày. - Độ ẩm: 75- 80 %.
Hình 3.3: Rễ Sâm Ngọc Linh 3.4. Nuôi cấy sinh khối (Dương Tấn Nhựt và cs)
3.4.1. Nguyên liệu:
Các mô sẹo đã hình thành
3.4.2. Môi trường:
Sử dụng môi trường nền MS. Ngoài ra bổ sung 1.0 mg/l 2.4 D và 0.2 mg/l TDZ.
3.4.3. Thiết bị và dụng cụ:
- Phòng chuẩn bị môi trường, khử trùng môi trường nuôi cấy, bảo quản dung dịch mẹ. Gồm có nồi hấp môi trường, tủ lạnh, bếp điện, cân phân tích, ống đong, pipet, máy đo pH.
- Phòng cấy vô trùng gồm tủ cây, đèn UV, các dụng cụ đã hấp vô trùng.
- Phòng lắc để nuôi cấy gồm hệ thống bình tam giác 250 – 300 ml, hay các hệ thống nuôi cấy bioreactor, máy lắc, máy lạnh, đèn chiếu sáng.
- Phòng thu, tách chiết hoạt chất. 3.4.4. Hóa chất: - Cồn 960, 700. - Nước cất vô trùng. - Dung dịch javel. 3.4.5. Qui trình thực hiện: - Cắt nhỏ các mô sẹo - Cho vào môi trường.
- Đậy nắp chai, bao giấy. Ghi ngày tháng, tên môi trường, giống. - Đem đi lắc lỏng (3 tháng).
- Sau thời gian này ta thấy khối lượng tế bào được nhân lên rất nhiều và có thể đem đi lọc để lấy tế bào nhằm thu sinh khối hay nhân sinh khối.
3.4.6. Điều kiện nuôi cấy:
- Nhiệt độ: 25 ± 20C.
- Cường độ chiếu sáng: 2.500- 3.000 lux. - Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ ngày. - Độ ẩm: 75- 80 %.
- Thời gian lắc lỏng: 3 tháng. - Số vòng: 100 – 120 vòng/ phút.
Hình 3.4: Nuôi cấy trong Bioreactor