ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VĂ PHƯƠNG PHÂP NGHIÍN CỨU 3.1 NỘI DUNG NGHIÍN CỨU
3.4.4.3.Quy trình xĩt nghiệm virut cúm gia cầm H5N1 bằng phương phâp Realtime RT-PCR
Realtime RT-PCR
Mây móc vă nguyín liệu
Hệ thống chiết tâch ARN Mây Realtime PCR Bộ Micropipet câc cỡ
Kít chiết tâch ARN (qiagen hoặc ambion magmax)
Kit RT-PCR: Qiagen One-step RT-PCR Kit (Cat No.210210) hoặc Invitrogen superscript III qRT-PCR kit (Cat No.12574-026)
Primer vă probe Tiến hănh
- Chiết tâch ARN: như quy trình chiết tâch ARN ở trín - Chuẩn bị Master mix (hỗn hợp nhđn gen):
Có thể dùng 1 trong 2 bộ kit nhđn gen, với lượng cụ thể cho một phản ứng như dưới đđy:
Qiagen one-step RT-PCR kit Invitrogen SS3 qRT-PCR kit Reagent Lượng (µl) Reagent Lượng (µl)
DW 10,5 DW 4,5
5x Reaction Mix 5,0 2x Reaction buffer
12,5 MgCl2 (25mM) 1,2 MgCl2 (50mM) 1,0
dNTP 0,8
PPP 1,5 PPP 1,5
Enzyme mix 1,0 Enzyme mix 0,5
- Cho 20 µl master mix văo ống PCR. - Cho 5 µl mẫu ARN văo ống PCR. - Đặt ống PCR văo mây real-time PCR.
- Chạy chương trình Real-time RT-PCR phât hiện gen của virut CGC đê căi đặt sẵn trín mây tính. Chu trình nhiệt cụ thể như bảng sau:
Qiagen one-step RT-PCR Kit Invitrogen superscript 3 qRT-PCR Kit
RT PCR RT PCR 500C-30m 950C-15m 40 x (950C-10s + 580C-50s) 500C-15m 950C-2m 40 x (950C-10s + 580C- 50s) Đọc kết quả
Xĩt nghiệm được công nhận khi: Đối chứng dương tính cho giâ trị chu kỳ Ct (threshold cycle) đê biết (±2). Đối chứng đm tính không có Ct.
- Mẫu được coi lă dương tính khi có Ct ≤ 35. - Mẫu được coi lă đm tính nếu không có Ct.
- Mẫu được coi lă nghi ngờ nếu Ct > 35. Mẫu nghi ngờ có thể được nhđn lín trín phôi trứng hoặc trín tế băo xơ phôi gă (CEF – Chicken Embrio Fibroblast) rồi xĩt nghiệm lại để có kết quả chính xâc.