ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VĂ PHƯƠNG PHÂP NGHIÍN CỨU 3.1 NỘI DUNG NGHIÍN CỨU
3.4.4.2. Quy trình chiết tâch ARN bằng kít Rneasy Mini Kit Qiagen (Sử dụng hệ thống hút chđn không)
hệ thống hút chđn không)
• Chuẩn bị
- Chuẩn bị mẫu như trong quy trình xử lý mẫu.
- Bổ sung lượng 1/100 β-Mercaptoethanol (β-ME) văo dung môi RLT. Chia dung môi sẵn văo câc ống 1,5 ml, lượng 600 µl/ống. Dung môi năy có thể bảo quản 1 thâng ở nhiệt độ phòng.
• Tiến hănh tâch chiết
- Lắc đều (Vortex) mẫu trong 5 giđy vă ly tđm nhanh (spin down). - Lấy 600 µl dung dịch RLT văo ống 1,5 ml.
- Chuyển 200 µl mẫu sang ống 1,5 ml đê có sẵn 600 µl RLT. - Lắc đều trong 15 giđy vă ly tđm nhanh .
- Cho 400µl cồn Ethanol 100% (cồn tuyệt đối).
- Lắc đều 15 giđy vă ly tđm 1 phút ở 10.000 vòng/phút (rpm) ở nhiệt độ phòng. - Đặt ống cột lọc (spin column) văo hệ thống hút chđn không.
- Chuyển tất cả dung dịch mẫu sang cột lọc vă bật mây hút.
• Rửa lần 1
Cho 700µl dung môi RW1 văo cột lọc vă bật mây hút.
• Rửa lần 2
- Cho 500µl dung môi RPE văo cột lọc vă bật mây hút. - Cho tiếp 500µl dung môi RPE văo cột lọc vă bật mây hút. - Đặt cột lọc văo ống thu mới (collection tube).
- Ly tđm cột lọc trong 2 phút ở 12.000 rpm.
Nếu không có hệ thống hút chđn không, câc bước dùng mây hút được thay thế bằng câch ly tđm cả cột lọc vă ống thu trong 1 phút ở tốc độ 10.000 vòng/phút.
• Thu hoạch ARN
- Chuyển cột lọc sang ống 1,5ml mới.
- Cho 50µl nước (RNase-free H2O) văo cột lọc, đợt 1 phút. - Ly tđm 1 phút ở tốc độ > 10.000 rpm.
- Chuyển mẫu ARN đê thu sang ống 1,5ml mới.
• Cất mẫu ARN
Cất mẫu ARN ở 40C trong ngăy nếu chạy phản ứng PCR ngay vă cất ở nhiệt độ -200C để lưu mẫu trong thời gian dăi.