ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VĂ PHƯƠNG PHÂP NGHIÍN CỨU 3.1 NỘI DUNG NGHIÍN CỨU
3.4.1.2. Phương phâp phât hiện khâng thể subtyp H5 bằng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu H
trở ngưng kết hồng cầu HI
Huyết thanh của gă thì không cần xử lý RDE (Receptor Destroying Enzyme), khâng huyết thanh vịt có thể xử lý bằng RDE để chống hiện tượng ức chế ngưng kết không đặc hiệu vă xử lý huyết thanh bằng câch hấp phụ lín hồng cầu để chống hiện tượng ngưng kết hồng cầu giả.
Chuẩn bị khâng nguyín:
• Pha khâng nguyín 4HA/25µl: Lấy độ pha loêng cuối cùng có phản ứng ngưng kết hồng cầu chia cho 4.
Ví dụ: Hiệu giâ HA của khâng nguyín lă 1/128. Đơn vị 4HA= 128:4=32.
Như vậy sẽ trộn 1 phần khâng nguyín với 31 phần PBS để đạt được dung dịch khâng nguyín 4HA. Tính lượng khâng nguyín cần dùng cho số mẫu huyết thanh cộng thím 1ml để đảm bảo lượng khâng nguyín dùng cho phản ứng.
• Chuẩn độ khâng nguyín 4HA:
Sau khi pha, khâng nguyín 4HA phải được chuẩn độ lại. Tiến hănh như phản ứng HA.
- Pha chuẩn: Kết quả ngưng kết xảy ra ở 2 giếng đầu. - Pha không chuẩn:
Khâng nguyín đặc: Nếu ngưng kết đến giếng thứ 3 tức lă thừa khâng nguyín. Như vậy khâng nguyín 8HA phải được pha loêng (có thể gấp đôi) để có ngưng kết đến giếng thứ 2.
Khâng nguyín loêng: Nếu ngưng kết đến giếng thứ 1 tức lă thiếu khâng nguyín, có thể thím một lượng khâng nguyín (bằng với lượng khâng nguyín pha ban đầu) để có ngưng kết đến giếng thứ 2.
Tiến hănh phản ứng HI:
- Nhỏ 25µl PBS văo câc giếng của đĩa 96 giếng. - Nhỏ tiếp 25µl khâng huyết thanh văo giếng đầu tiín.
- Pha loêng khâng huyết thanh theo cơ số 2: Chuyển 25µl khâng huyết thanh từ giếng 1 sang giếng 2 vă tuần tự đến giếng 11 vă bỏ đi 25µl cuối cùng.
- Nhỏ 25µl khâng nguyín 4HA đê chuẩn bị văo câc giếng từ giếng 1 - 11. Thím 25µl PBS văo hăng đối chứng hồng cầu (giếng 12).
- Lắc đĩa vă ủ ở nhiệt độ phòng 30 phút.
- Nhỏ 25µl dung dịch hồng cầu văo tất cả câc giếng của đĩa, lắc đều. - Để đĩa ở nhiệt độ phòng 40 phút.
Đọc kết quả:
Phản ứng dương tính: Hồng cầu lắng xuống đây.
Hiệu giâ HI của mẫu được tính ở độ pha loêng huyết thanh cao nhất còn có hiện tượng ức chế ngưng kết hồng cầu.
Phản ứng đm tính: Hồng cầu bị ngưng kết.
Chú ý: Khi kiểm tra huyết thanh vịt nín có 1 giếng chỉ có huyết thanh vă hồng cầu để kiểm tra hiện tượng ngưng kết hồng cầu không đặc hiệu. Nếu phât hiện thấy có ngưng kết xảy ra với mẫu huyết thanh năo cần xử lý lại mẫu huyết thanh đó vă kiểm tra lại bằng phản ứng HI.