2.4.3.1 Kỹ thuật lấy bệnh phẩm
Thực hiện theo thường quy của labo ủối với từng loại bệnh phẩm lấy vào lọ vụ khuẩn hoặc tăm bụng vụ trựng, tiến hành tại cỏc khoa lõm sàng mang về
khoa Vi Sinh Bệnh viện Bạch mai.
2.4.3.2 Nuụi cấy, phõn lập và xỏc ủịnh vi khuẩn
Thực hiện theo theo thường quy labo và cỏc quy ủịnh của WHO
- Nhuộm Gram xem hỡnh thể tớnh chất bắt màu vi khuẩn, tế bào bạch cầu
ủa nhõn.
- Nuụi cấy bằng cỏch ria phõn vựng trờn cỏc loại mụi trường phõn lập, mụi trường dành cho E. coli, K. pneumoniae.
- Nhận ủịnh khuẩn lạc
- Định danh bằng thanh API 20E của hóng Bio-Merieux Phỏp, nếu cần khẳng ủịnh lại bằng mỏy ủịnh danh vi khuẩn BD Phoenix của Mỹ.
2.4.3.3 Kỹ thuật khỏng sinh ủồ Kirby- Bauer
Tất cả cỏc chủng E. coli và K. pneumoniae phõn lập ủược làm khỏng sinh ủồ theo kỹ thuật Kirby - Bauer theo hướng dẫn của CLSI năm 2006, 2008 và 2009 [5], [16], [30], [49], [51].
Nguyờn lý
Cỏc loại khỏng sinh khỏc nhau ủó ủược tẩm trong cỏc khoanh giấy sẽ
khuyếch tỏn trong thạch và kỡm hóm sự phỏt triển của chủng vi khuẩn trờn bề mặt thạch, tạo thành cỏc vựng ức chế. Dựa vào ủường kớnh vựng ức chế ủểủỏnh giỏ mức ủộ nhạy cảm của khỏng sinh tương ứng.
Chuẩn bị vật liệu
- Mụi trường Muller-Hinton ủó kiểm tra cỏc tiờu chuẩn chất lượng tốt - Khoanh giấy khỏng sinh ủặt ở nhiệt ủộ phũng 30 phỳt trước khi dựng - Nước muối sinh lý 0,85% ủể pha ủộủục.
- Mỏy ủo ủộ ủục chuẩn Mc Farland 0,5 tương ủương 108 CFU/ml (CFU- colony forming unit).
Cỏc bước tiến hành
- Pha huyền dịch bằng cỏch lấy 3 ủến 5 khuẩn lạc thuần khiết pha vào dung dịch nước muối sinh lý và lắc ủều bằng mỏy voltex, so ủộ ủục chuẩn tương ủương Mc Farland 0,5.
- Ria ủều vi khuẩn lờn mặt ủĩa thạch và ủể khụ ở nhiệt ủộ thường
- Đặt khoanh khỏng sinh vào ủĩa bằng kim nhọn, khoảng cỏch cỏc khoanh khoảng 20 - 25mm và cỏch thành ủĩa từ 10 - 15mm.
- Để nhiệt ủộ phũng 15 phỳt - Ủấm 350C-370C/24h
- Đọc kết quả bằng thước ủo milimet
- Nhận ủịnh kết quả: xỏc ủịnh cỏc mức ủộ S, I, R theo quy ủịnh của hóng cung cấp khoanh giấy.
- Quản lý số liệu bằng phần mềm Whonet 5.4 Kiểm tra chất lượng
Chủng quốc tế: E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853 2.4.3.4 Kỹ thuật xỏc ủịnh ESBL
Tất cả cỏc chủng E. coli và K. pneumoniae ủều ủược phỏt hiện sinh ESBL bằng cả 3 phương phỏp: ChromID ESBL, ủĩa ủụi, E-test ESBL.
Phương phỏp sàng lọc bằng mụi trường ChromID ESBL Mục ủớch
Sàng lọc E. coli và K. pneumoniae sinh ESBL
Nguyờn tắc
- Mụi trường cú khỏng sinh cefpodoxime nờn chỉ trực khuẩn ủường ruột sinh ESBL mọc ủược.
- Mụi trường cú 2 chất màu và 1 chất tự nhiờn cú khả năng xỏc ủịnh hầu hết cỏc trực khuẩn ủường ruột sinh ESBL.
Cỏc bước tiến hành
- Ria cỏc chủng vi khuẩn cần thử lờn mụi trường ChromID ESBL. - Ủấm 350C-370C/24h.
Đọc kết quả
- Dương tớnh: E. coli và K. pneumoniae cú khả năng mọc trờn mụi trường ChromID ESBL và khuẩn lạc cú sắc tố.
- Âm tớnh: Vi khuẩn khụng mọc Nhận ủịnh kết quả
- E. coli sinh ESBL mọc trờn mụi trường ChromID ESBL và khuẩn lạc cú màu hồng hoặc tớm nhạt.
- K. pneumoniae ESBL (+) mọc trờn mụi trường ChromID ESBL và khuẩn lạc cú màu xanh nhạt.
- Lưu ý: Một số chủng khỏng cefpodoxime khụng sinh ESBL cú thể
mọc như sinh cephalosporinase, penicilinase, ủề khỏng khỏc.
Bảng 2.1: Nhận ủịnh kết quả vi khuẩn sinh ESBLtrờn mụi trường ChromID ESBL
Nhận ủịnh khuẩn lạc vi khuẩn ESBL
E. coli K. pneumoniae
Dương tớnh Màu hồng, tớm nhạt Xanh nhạt Âm tớnh - Khụng mọc
- Mọc khụng sinh màu
- Khụng mọc
- Mọc khụng sinh màu
Hỡnh ảnh 2.2: E. coli và K. pneumoniae sinh ESBL (+) trờn mụi trường ChromID ESBL.
Phương phỏp ủĩa ủụi
Hướng dẫn của David M Livermore, phũng thớ nghiệm chuẩn thức và giỏm sỏt ủề khỏng khỏng sinh Anh quốc [44], [54], [64].
Nguyờn lý
Cỏc khoanh giấy khỏng sinh CAZ, CTX, AMC ủặt ở cỏc vị trớ quy ủịnh thành một ủường thẳng trờn mặt ủĩa thạch sẽ khuyếch tỏn ủều xung quanh. Cỏc ESBL cú khả năng phõn hủy cỏc cephalosporin phổ rộng nhưng bị ức chế bởi clavulanic acid, dẫn ủến xuất hiện vựng ức chế vi khuẩn với ủường kớnh nhạy cảm (S) xung quanh khoanh giấy khỏng sinh AMC và mở rộng vựng ức chế giao thoa giữa AMC với CAZ và CTX. Cỏc bước tiến hành
- Pha huyền dịch vi khuẩn cú ủộủục Mc Farland 0.5 - Ria ủều vi khuẩn lờn mặt ủĩa thạch Muller-Hinton
- Đặt khoanh giấy AMC 30àg (amocillin/clavulanic acid 20àg/10àg)
ở vị trớ trung tõm và cỏc khoanh CAZ, CTX xung quanh, cỏch khoanh AMC khoảng 20-25mm, cỏch thành ủĩa 10 mm sao cho ba khoanh CAZ, AMC và CTX nằm trờn một trục thẳng.
- Ủấm 350C - 370C/24h Đọc kết quả
- Vi khuẩn nhạy cảm với AMC (≥18 mm)
- Cú sự mở rộng vựng ức chế về khoanh AMC hoặc tạo vũng giao thoa hỡnh ellip, hỡnh trũn ở giữa hai khỏng sinh AMC và CAZ hoặc CTX.
Bảng 2.2: Nhận ủịnh kết quả vi khuẩn sinh ESBL theo phương phỏp ủĩa ủụi
ESBL CAZ CTX AMC
Dương tớnh ỉ ≤ 22mm ỉ ≤ 27mm Nhạy cảm ( ỉ ≥ 17 mm) Âm tớnh ỉ bất kỳ (S, I, R) ỉ bất kỳ (S, I, R) I, R (ỉ < 17 mm) * (ỉ: ủường kớnh)
Hỡnh ảnh 2.4: Sinh ESBL(+): Vi khuẩn nhạy AMC, khỏng CAZ và CTX. Đồng thời cú hiện tượng mở rộng vựng ức chế vi khuẩn về phớa CTX.
Hỡnh ảnh 2.5: Vi khuẩn khụng sinh ESBL.
Hỡnh ảnh 2.6: Vi khuẩn khụng sinh ESBL.
Cú mở rộng vựng ức chế vi khuẩn về phớa CAZ nhưng vi khuẩn trung gian AMC
Phương phỏp E-test ESBL [33], [41], [46], [54]. Nguyờn lý
Sử dụng băng giấy E-test ESBL một phần chứa cephalosporin phổ rộng (ký hiệu là CT, TZ) ủược chia thành nhiều nồng ủộ, phần cũn lại chứa cephalosporin phổ rộng + clavulanic acid 4àg/ml (ký hiệu là CT/CTL, TZ/TZL) ủể phỏt hiện sự ức chế bởi clavulanic acid của E. coli và K. pneumoniae sinh ESBL.
Cỏc bước tiến hành
- Pha huyền dịch vi khuẩn
- Ria ủều vi khuẩn lờn mặt ủĩa thạch
- Đặt băng giấy khỏng sinh lờn ủĩa ủó ria vi khuẩn - Ủấm 350C-370C/24h
Đọc kết quả
Nồng ủộ MIC ủược ủọc dựa vào ủiểm tiếp xỳc giữa vựng ức chế vi khuẩn hỡnh ellip với ủiểm tiếp xỳc băng giấy E-test ESBL trờn mặt thạch.
Nhận ủịnh kết quả
Vi khuẩn ESBL (+) cú nồng ủộ MIC ở phần khỏng sinh CAZ hoặc CTX
ủơn thuần so với MIC phớa chứa clavulanic acid kết hợp CAZ hoặc clavulanic acid kết hợp CTX lớn gấp ≥ 8 lần. Bảng 2.3: Nhận ủịnh kết quả E-test ESBL. ESBL Nồng ủộ MIC àg/ml Lưu ý Dương tớnh - CTX ≥ 0,5 và CTX/CTX + Clav ≥ 8 - Hoặc CAZ ≥1 và CAZ/CAZ + Clav ≥ 8 - Hoặc cú búng vựng ức chế - Hoặc biến dạng của phần CTX - Hoặc CAZ hỡnh ellip
Sinh ESBL sẽ khỏng toàn bộ penicillins, cephalosporins và aztreonam Âm tớnh - CTX < 0,5 và CTX/CTX +Clav < 8 - Hoặc CAZ <1 và CAZ/CAZ + Clav < 8
E-test ESBL(-), khụng cho biết toàn bộ khoảng giỏ trị
MIC. Nếu cần sử dụng thờm phương phỏp MIC Khụng xỏc ủịnh (ND: Non Determinable) - CTX > 16 và CTX/Clav > 1 và CAZ > 32 và CAZ/Clav > 4 - Hoặc khi một băng giấy ESBL õm tớnh và thanh kia ND với lý do khỏc
E-test ESBL sẽ khụng cho biết toàn bộ cơ chế ủề
khỏng, ủể tỡm hiểu thờm CLSI khuyến cỏo nờn sử
dụng phương phỏp MIC hoặc xỏc ủịnh gen
(Ghi chỳ: CT = CTX, TZ = CAZ, CTL = Cefotaxime kết hợp clavulanic acid, TZL = ceftazidime kết hợp clavulanic acid).
Một số lưu ý khi ủọc kết quả E-test ESBL:
Kết quả E-test ESBL ủược coi là õm tớnh khi
- MIC CTX < 0,5àg/ml hoặc MIC CAZ < 1àg/ml
- MIC CTX/Clav hoặc CAZ/Clav cao hơn MIC CTX hoặc CAZ (cú thể
là trường hợp sinh ò-lactamase khỏng lại clavulanic acid).
- Cả hai giỏ trị MIC ngoài giới hạn ủược coi là khụng xỏc ủịnh (ND) và gợi ý về IRT hoặc AmpC hoặc chỉ là trường hợp MIC ngoài giới hạn Kết quả E-test ESBL ủược coi là khụng xỏc ủịnh (ND) khi
Một băng giấy là õm tớnh cũn băng kia là ND thỡ thử nghiệm E-test ESBL ủược ủọc là ND.
Hỡnh ảnh 2.10: E-test ESBL phỏt hiện K. pneumoniae sinh ESBL(+).
Hỡnh ảnh 2.11: Phương phỏp E-test ESBL phỏt hiện K. pneumoniae sinh ESBL (+) (cú biến dạng vựng ức chế).
Hỡnh 2.2: Sơủồ túm tắt quỏ trỡnh nghiờn cứu
Bệnh phẩm
Nhuộm Gram Nuụi cấy
Định danh E. coli và
K. pneumoniae
Khỏng sinh ủồ Kirby - Bauer chọn E. coli và K. peumoniae cú DD CAZ ≤ 22mm và CTX≤ 27mm Đọc kết quả Diễn giải kết quả Thử nghiệm phỏt hiện ESBL - ChoromID ESBL - Đĩa ủụi - E-test ESBL