- PCR là phương pháp dùng enzyme khuếch đại chọn lọc một đoạn DNA theo luật số mũ. Phản ứng được thực hiện với enzyme DNA chịu nhiệt, hai mồi tổng hợp và 4 loại deoxyribonucleic (dATP, dGTP, dCTP, dTTP). Mỗi chu kỳ phản ứng gồm 3 chu kỳ:
+ Biến tính DNA có tác dụng tách 2 sợi đơn từ sợi khuôn khép, nhiệt độ biến tính khoảng 950 C trong 30-60 giây.
+ Bắt cặp hai mồi và hai sợi đơn của khuôn, nhiệt độ khoảng 40-700 C, kéo dài 30- 60 giây.
+ Bước tổng hợp, kéo dài chuỗi nhiệt độ 720 C giúp cho enzyme DNA polymerase hoạt động tổng hợp tốt nhất.
- Ưu điểm của phương pháp này là: + Thời gian cho kết quả nhanh.
+ Có thể phát hiện được những vi sinh vật khó nuôi cấy. + Ít tốn kém về mặt nhân sự.
+ Hóa chất dễ tìm kiếm và tồn trữ. - Khuyết điểm:
+ Tất cả các tế bào chết và tế bào sống đều cho kết quả dương tính trong kỷ thuật PCR.
+ Mật độ vi sinh vật hiện diện trong mẫu thường thấp, nên cần phải có thêm bước nuôi cấy để có mật độ đủ để phát hiện bằng PCR.
- Ứng dụng:
+ Dòng hóa các gene hay một đoạn gene, đoạn RNA. + Tạo đột biến.
+ Định lượng những khác biệt trong thể gene RT-PCR. + Điều tra hình sự.
+ Kiểm tra chất lượng, sự lẫn tạp sinh học.
Bảng: Hỗn hợp một phản ứng PCR (Bùi Đức Trí 2006).
Hóa chất Thể tích Nồng độ 10xPCR buffer 5µl 1X 10xdNTPs (2nM) 5µl 200µM
Primer xuôi (10pmol s/µl 5µl 1µM (50pmol s/50µl) Primer ngược (10pmol
s/µl)
5µl 1µM (50pmol s/50µl)
Mẫu DNA 2µl 1µM
Tap DNA polymerase (2U/µl)
0.5µl 1µg
H2O 27.5µl 1unit
- Một vài nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR để phát hiện gene độc lực của S.aureus. + Ở Akineden, 2001 đã dùng kỹ thuật PCR khuếch đại phát hiện gene độc lực của
S.aureus trong sữa bò có độc tố ruột A (SEA), SEC, SED, SEG, SEI, SẸ, TSST-1 nhưng không thấy SEB, SEE, SHE và có cả sự hiện diện của hai độc tố màng ngoài là ETA và ETB.
+ Abdulmula E1-Ghodban, 2005 đã khảo xác 63 dòng S.aureus (40 từ nguồn bệnh sốc độc tố và 23 nguồn từ thức ăn) tìm độc tố TSST-1 bằng PCR. Chỉ có 3 dòng được phát hiện có sự hiện diện của TSST-1.
+ L.Chapaval, 2006 khảo xác 132 dòng vi khuẩn được phân lập từ sữa nguyên kem có sự hiện diện của độc tố ruột và TSST-1.
Phương pháp PCR xác định coaguase của S.aureus trong sữa. - Vật liệu:
+ 628 mẫu sữa được lấy từ các trang trại nuôi bò ở Murrah. Vi khuẩn kiểm tra: lấy 10 µl sữa từ mỗi mẫu rồi cấy ria 5% đĩa thạch máu cừu và cấy trên đĩa thạch lactose của Mac Conkey sau đó ủ trong 24 giờ ở 370C
+ Theo dõi sự phát triển của khuẩn lạc : Gram dương, catalase dương tính, oxidase âm tính → xác định là Staphylococcus. ssp. Tụ cầu phân lập được tiếp tục phân loại coalugase (+) và (-) bằng thử nghiệm Citrate trên môi trường huyết tương thỏ (Gibbs và Skinner, 1966). Lấy mẫu coalugase (+) tiếp tục xác định đặc điểm sinh hóa theo thử nghiệm enzyme chịu nhiệt (Faruki và Mumbai, 1986). Sau đó kiểm tra bằng ngưng kết Latex (Staph Latex Test Kit, Himedia , Mumbai) và lên men Mannitol.
+ DNA lấy trực tiếp từ sữa bằng phương pháp Phuektes (2001). Lấy 1,5 ml sữa li tâm với 600 ml đệm NTE. Vorter mẫu và ổn định dịch bằng 100 µl (24% sodium dodecyl sulphate) và giữ trong bể nước (800C, trong 10´). Sau đó cho thêm 12µl protein asek (20mg/ml, Fermentas, USA) và ủ tiếp trong bể nước (560C, 2h)
- Hút 100µl NaCl 5M và 80µl CTAB-NaCl cho thêm vào ủ (560C, 10´). Sau đó cho thêm PCI (phenol chloroform isoamyl alcohol) và CI (chloroform isoamyl alcohol) cho đến khi mẫu được làm sạch.
- Thu nhận kết quả ở 1/10 thể tích sodium acetate 3M (pH=5.2) và thêm 2 thể tích ethanol 100% lạnh vào, giữ ở -200C để kết tủa DNA. Sau đó li tâm 15000 vòng/15´ ở 40C để tách ethanol và thu DNA, sau đó rửa DNA 2 lần bằng ethanol 70%, cuối cùng làm khô.
- Sau đó, DNA được hòa tan trong 50µl đệm TE và giữ ở -200C đến khi sử dụng tiếp. - Tách DNA từ vi khuẩn nuôi cấy:
+ DNA được tách ra từ những vi khuẩn đã được phân lập trước đó. Những dòng khuẩn lạc riêng rẻ được để qua đêm trong 25µl dung dịch đệm TE và đun sôi đến 990C trong 15´ sau đó làm lạnh nhanh bằng cách đặt trên băng.
+ Các mẫu kết quả DNA thu được, được bảo quản ở -200C và 5µl của mỗi mẫu được sử dụng để phân tích PCR.
- Phản ứng PCR thực hiện với MgCl2, Tap DNA polymerase, mồi. Cặp mồi:
F: ACCACAAGGTACTGAATCAACG R: TGCTTTCGATTGTTCGATGC
(Aarestrupetal., 1995)
- Phản ứng PCR của Martineau et.al (1998): Sử dụng cặp mồi
F: AATCTTTGTCGGTACACGATATTCTTCACG.
R: CGTAATGAGATTTCAGTAGATAATACAACA.
- PCR được thực hiện trong bể luân nhiệt. DNA phân lập từ chủng S.aureus ATCC25923.
- Phân tích sản phẩm PCR: sau khi khuếch đại sản phẩm PCR sẽ được chạy trên gel agarose 2% trong đệm 0,5X Tris Borate EDTA (ethidium bromide 0,2µl/ml)
- Gen 100bp được sử dụng làm mục tiêu.
- Hiệu điện thế được sử dụng 6,5V và chạy điện di trong 1h. Sử dụng tia UV để xác định sự hiện diện của vi khuẩn. Độ nhạy của mồi được đánh giá bằng cách sử dụng các dung dịch pha loãng khác nhau (CFU/ml) của vi khuẩn.
Hình 1. Coa gene amplification of Staphylococcus aureus.
Lane 1, 9, 11, 12: 610 bp; Lane 13: Negative control; Lane 5, 6, 8, 10: 740bp; Lane L: 100bp Ladder Lane 2, 7: 870bp;
Lane 3: 960 bp; Lane 4: coa negative;
- Hỗn hợp phản ứng tối ưu hóa của gen coalugase dựa trên thí nghiệm chứa 200µl dNTP mix, 1 dung dịch đệm PCR với 10mMTris – HCL, pH = 8,8 , 50nM KCl và 0,8% Nonidet P40); 1,5 mM MgCl2; 20pmol của mỗi mồi; 2,5U Taq DNA polymerase và 200µl DNA được tách chiết từ sữa và 25µl DEPC.
- Biến tính DNA ở 950C trong 5´, 36 chu kì. Sau đó ủ ở 550C trong 1´ và kéo dài ở 720C trong 1.´.
- Phản ứng PCR được tối ưu hóa khi nồng độ MgCl2 là 2,5mM.
- Kiểm tra 628 mẫu sữa thì có 238 mẫu chiếm (37, 89%) các chủng dương tính. Dựa vào đặc điểm gram và haemolysis có 156 mẫu chứa tụ cầu (65,55%).
- Tụ cầu được phân lập từ các chủng tiếp tục phân thành 128 coalugase (+) (53,78%) và 28 coalugase (-) (11,78%). Trên cơ sở thử nghiệm citrate coalugase huyết tương thỏ các coalugase (+) được phân lập và xác định sinh hóa như S.aureus.
- S.aureus được phân lập và sàng lọc bằng gen coalugase dựa trên những điều kiện tối ưu của phản ứng PCR thường có độ nhạy 100%.
- S.aureus được phân lập có sản phẩm khuếch đại có kích thước 108bp. - Kết quả:
Hình 2. Ubiquitous PCR assay for Staphylococcus aureus.
Lane 1-4: Staphylococcus aureus Positive samples; Lane 5: Staphylococcus aureus ATCC 25923; Lane 6: Negative control with Nuclease free water; Lane L: 100bp Ladder;
Ứng dụng:
Phương pháp này được ứng dụng cho việc xác định sự sản sinh enterotoxin của
Staphylococus aureus trong thực phẩm và trong môi trường nuôi cấy lỏng.
Nguyên tắc:
+ Thực phẩm nhiễm độc S.aureus thường chứa ít hơn 10ng độc tố/ 1g thực phẩm. Để phát hiện enterotoxin với mức độ thấp như trên mà không dùng biện pháp cô đặc cao độ, chỉ có phương pháp RIA (Radio Immuno Assay); enzyme liên kết khảo nghiệm miễn dịch ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay); khảo nghiệm ngưng kết huyết thụ động đảo ngược RPHA (Reverse passive hemagglutiation assay) là đủ nhạy. RPHA là biện pháp đơn giản nhất để thực hiện nhưng đôi khi nó cũng cho ra những phản ứng không đặc hiệu với những loại thực phẩm nhất định. Để khắc phục những vấn đề này khảo nghiệm ngưng kết latex thụ động đảo ngược RPLA đã được phát triển. Trong thử nghiệm này, kháng thể phủ hạt nhựa polystyrence thay thế cho các tế bào máu được sử dụng trong phương pháp RPHA. Phương pháp RPLA được dùng để phát hiện độc tố tụ cầu A, B,C, D (SEA, SEB, SEC, SED).
+ Kits là tên thương mại của bộ dụng cụ để thực hiện khảo nghiệm khảo nghiệm này.
Sau đây là mô tả về phương pháp RPLA.
Vật liệu và thiết bị:
+ Lưu ý: các thiết bị sử dụng trong Phương pháp RPLA phải được chuẩn bị và khử trùng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
+ SET_RPLA: Kit cho độc tố A, B, C, D.(được sản xuất từ Oxoid Canada hoặc Fisher Scientific). Gồm các chất thử sau đây đủ để thực hiện thử nghiệm trên 20 mẫu.
+ Huyền phù latex có độ nhạy sáng với kháng nguyên SEA, SEB, SEC, SED 5ml/lọ.
+ Huyền phù latex đối chứng 5ml/lọ.
+ SEA, SEB, SEC, SED được đông khô và bổ sung 0.5ml dung dịch chất làm loãng.
+ Dung dịch pha loãng (muối đệm phosphate chứa 0.5% (w/v)) huyết thanh bò và 50ml sodium azide 0.1 %.
+ Muối đệm phosphate (phosphate 0.05M, NaCl 0.15M, chứa 0.05% sodium azide pH 7.4).
+ Sodium hypochloride 2%(NaOCl). + Sodium hydroxide 4N (NaOH). + Acid hydrochloride 4N (HCl).
+ Tấm vi chuẩn (loại hình chữ V, có 8×12 giếng) và nắp đậy. + Micropipette (25µl) và các tip.
+ Platform shaker (nền lắc).
+ Blender hoặc homogenizer (máy trộn, máy làm đồng nhất). + Refrigerate centrifuge (máy li tâm làm lạnh).
Cách tiến hành: *Giới thiệu chung:
+ Kit SET-RPLA phải được bảo quản ở nhiệt độ 2-80C. Trong điều kiện này các chất thử sẽ giữ lại khả năng phản ứng đến ngày ghi trên hộp kit. Sau khi hoàn nguyên, những đối chứng enterotoxin nên được bảo quản ở nhiệt độ 2-80C. Những đối chứng enterotoxin hoàn nguyên sẽ được giữ lại khả năng phản ứng trong 3 tháng hoặc đến ngày ghi trên hộp kit.
+ Những chất thử có nhiều nồng độ khác nhau vì vậy không nên đổi chổ lẫn nhau. + Những chất thử và chất làm loãng chứa sodium azide 0.1% và được sử dụng như chất bảo quản.
+ Một thùng chứa chất thải của sodium hypochloride 2% nên được chuẩn bị và sử dụng cho việc xử lý tất cả các mẫu dịch từ môi trường, mẫu dịch chiết thực phẩm, đối chứng độc tố…
*Chuẩn bị mẫu:
+ Đối với những thực phẩm có độ ẩm cao (thịt đông lạnh, hải sản, nấm đóng hộp, …). Cho 50g mẫu và 50ml muối đệm phosphate vào một máy xay. Trộn lẫn với tốc độ cao trong 2 phút, sau đó để yên đồng nhất trong 10 phút ở nhiệt độ phòng.
+ Đối với thực phẩm bán khô (pho mai, giăm bong, xúc xích, bánh ngọt,…). Cho 50g mẫu và 100ml muối đệm phosphate vào một máy xay. Trộn với tốc độ cao trong 2 phút, sau đó để yên đồng nhất trong 10 phút ở nhiệt độ phòng.
+ Đối với những thực phẩm khô (mì khô, bột sữa,…). Cho 50g mẫu vào và 150ml muối đệm phosphate vào một máy xay. Trộn với tốc độ cao trong 2 phút, sau đó để yên đồng nhất trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. (Với mì khô, đầu tiên mẫu được trộn riêng tốc độ cao trong 2-3 phút đến khi mẫu chuyển thành bột , sau đó thêm muối đệm phosphate và trộn các thành phần với nhau, để yên 1-2 giờ ở nhiệt độ 40C. Trộn lại một lần nữa với tốc độ cao trong 2-3 phút, sau đó để yên đồng nhất trong 10 phút ở nhiệt độ phòng.
+ Chuẩn bị xong, ly tâm đồng nhất với tốc độ 10000 vòng/phút, trong 20 phút ở 40C.
+ Gạn bỏ phần nổi trên mặt.
+ Nếu phần nổi vẫn còn (như trong pho mai và các sản phẩm từ sữa khác), điều chỉnh pH đến 4.6 với HCl 4N. Ly tâm như trên và trung hòa dịch huyền phù bằng NaOH 4N. Nếu huyền phù vẫn còn, tiếp tục ly tâm nữa. Phương pháp RPLA yêu cầu mẫu dịch chiết thực phẩm không chứa vẫn đục để giảm thiểu phản ứng không đặc hiệu.
+ Một vài thực phẩm như mì khô thường cho các kết quả dương tính giả bằng thí nghiệm trực tiếp. Như vậy dịch chiết từ thực phẩm phải được tiến hành làm sạch hoặc cô đặc của sắc ký ái lực chelate kim loại. (Xem bảng 1).
* Khảo nghiệm RPLA:
+ Mỗi mẫu dịch chiết từ thực phẩm được khảo nghiệm ở 20 giếng của tấm vi chuẩn như sau:
Mỗi trong 4 độc tố (enterotoxin) SEA, SEB, SEC, SED được cho vào 4 giếng và 1 giếng đối chứng latex.
Mỗi mẫu dịch chiết có thể cần 6 hoặc nhiều hơn 6 giếng cho 1 trong 4 độc tố (enterotoxin) phụ thuộc vào lượng độc tố được sinh ra trong dịch chiết đó.
Ghi kí hiệu trên tấm vi chuẩn: các lọai độc tố SEA, SEB, SEC, SED và latex đối chứng theo chiều dọc; độ pha loãng (0, 2X, 4X, 8X…) theo chiều ngang.
Chú ý: Mỗi ngày khảo nghiệm, hoạt động của mẫu huyền phù latex có độ nhạy sáng với kháng nguyên SEA, SEB, SEC, SED. Các mẫu huyền phù latex đối chứng được kiểm tra sự chống lại những enterotoxin tương ứng của chúng như đối chứng dương và dung dịch pha loãng như chứng âm. Không cần lặp lại những đối chứng này cho mỗi mẫu nếu các mẫu được khảo sát trong cùng một ngày. Loại bỏ những chất thử không đảm bảo yêu cầu về độ nhạy và độ đặc hiệu.
+ Cho 25µl dung dịch pha loãng vào mỗi giếng trừ giếng đầu tiên- giếng chứa những mẫu không pha loãng để xác định mỗi loại enterotoxin và đối chứng latex.
+ Thêm 25µl dịch chiết từ thực phẩm vào giếng đầu tiên và giếng thứ 2 (2X) để xác định mỗi loại enterotoxin và đối chứng latex (kí hiệu là A, B, C, D và L, một cách tương ứng).
* Xác định SEA:
+ Trộn kỹ hỗn hợp ở giếng thứ 2 (2X) (kí hiệu A) bằng cách bơm dung dịch vào ra micropipette ít nhất 5 lần.
+ Chuyển 25µl từ giếng 2 sang giếng thứ 3(4X), trộn tương tự như trên. + Chuyển 25µl từ giếng 3 sang giếng thứ 4(8X), trộn tương tự như trên. + Tiếp tục pha loãng 2 lần đến giếng thứ 5, 6 nếu thấy cần thiết.
+ Lặp lại tương tự các bước cho việc xác định SEB, SEC, SED và đối chứng Latex (kí hiệu B, C, D và L).
+ Lắc mạnh mỗi huyền phù latex trước khi sử dụng.
+ Thêm 25µl huyền phù latex nhạy với kháng nguyên A vào một trong 4 giếng ở loạt đầu tiên (A).
+ Thêm 25µl huyền phù latex nhạy với kháng nguyên B vào một trong 4 giếng ở loạt 2 (B).
+ Thêm 25µl huyền phù latex nhạy với kháng nguyên C vào một trong 4 giếng ở loạt 3 (C).
+ Thêm 25µl huyền phù latex nhạy với kháng nguyên D vào một trong 4 giếng ở loạt 4 (D).
+ Thêm 25µl huyền phù đối chứng latex vào một trong 4 giếng ở loạt 5 (L).
+ Đặt vạch tấm vi chuẩn xuống đáy của một cái hộp với 2 lớp giấy lọc nước bão hòa lốt hộp để duy trì ở 1atm. Ngoài ra, các giếng thí nghiệm được bịt lại bằng nắp hoặc một tấm phủ bằng nhựa để ngăn cản sự bốc hơi nước. Trong trường hợp này không cần thiết để tấm vi chuẩn trong một hộp ẩm.
+ Lắc tấm vi chuẩn trong hộp chứa nó 100 vòng/phút trên một nền lắc hoặc bằng tay khoảng 1-2 phút. Phải cẩn thận để không làm tràn các thành phần trong các giếng.
+ Để yên tấm vi chuẩn trên một bề mặt dao động tự do ở nhiệt độ phòng trong 20- 24 giờ.
+ Kiểm tra các giếng có ngưng kết latex với một nền đen.
*Giải thích kết quả:
So sánh mức độ ngưng kết của các hạt latex.
+ Những giếng có khả năng ngưng kết ở mức độ từ (+) đến (+++) đươc xem là dương tính cho loại độc tố đặc hiệu.
+ Nếu phản ứng ngưng kết không rõ ràng, quan sát phản ứng bằng kính nhìn nổi 3 chiều hoặc kính lúp với độ phóng đại 10 lần (10X).
+ Các đối chứng latex nên là âm tính.
+ Trường hợp xảy ra ngưng kết không đặc hiệu trong các giếng đối chứng latex. Nếu điều này xảy ra các giếng mẫu vẫn có thể đọc là dương tính (nếu giếng mẫu dương tính có nồng độ pha loãng cao hơn so với giếng đối chứng có ngưng kết không đặc hiệu).
+ Nếu tất cả các giếng của độc tố A, B, C, D đều hiển thị các kết quả là dương tính với mức độ ngưng kết như nhau, thí nghiệm này được xem là dương tính giả.
+ Trong trường hợp này, mẫu dịch chiết thực phẩm phải qua bước làm sạch hoặc cô đặc liên quan đến sắc ký ái lực chelate kim loại.
+ Lượng enterotoxin tồn tại trong mẫu có thể ước tính bằng cách so sánh những kết quả ngưng kết với khả năng cô đặc chuẩn của các độc tố. Độ nhạy của thí nghiêm này là 0.5-1ng độc tố/ml mẫu dịch chiết. Nếu các enterotoxin không có giá trị, một mức