enterotoxins bằng ELISA có trong kem lạnh và tiêu thụ pho mát trong tỉnh Burdur, Turkey:
Vật liệu và phương pháp:
+ Mẫu: Trong nghiên cứu này, 50 mẫu kem và 50 mẫu pho mát trắng ( mỗi mẫu 250g) được lấy từ Burdur, Turkey. Kem và pho mát thường được nông dân sản xuất với phương pháp truyền thống và công khai bán ở chợ. Tất cả các mẫu được thu thập trong các túi nhựa vô trùng và vận chuyển đến phòng thí nghiệm.
+ Đếm tổng vi khuẩn hiếu khí mesophilic bacteria: Tổng vi khuẩn hiếu khí (TAMB) được xác định bằng phương pháp thông thường (Maturin và Peeler, 1998). Mỗi mẫu 10g huyền phù trong 90ml nước môi trường peptone vô trùng ( 0.85% NaCl 0.1% peptone) và nhỏ 0.05ml ở các độ pha loãng 10-1- 10-6 vào đĩa thạch ( Merck, Darmstadt, Germany). Sau 48 ± 2h ủ ở 30±10C, CFU, tính cho mỗi gram mẫu.
+ Đếm Staphylococcus spp. và S. Aureus: 10g mẫu được pha loãng với 90ml nước môi trường peptone vô trùng và đồng nhất trong máy đồng nhất mẫu (Masticator, IUL Instruments – Spain). Pha loãng dung dịch mẫu 10-1- 10-6 lấy 0.1ml ở mỗi độ pha loãng, câý trang trên bề mặt thạch Baird – Parker (BD, Becton Dickinson, công ty Pháp), có thêm lòng đỏ trứng. Ủ các đĩa thạch này ở 370 C trong 24-48h. Các khuẩn lạc được phân lập đặc trưng là S.aureus (có tâm đen, trơn nhẵn, lồi, mép rìa tròn, mờ đục và có vòng sáng xung quanh), (Bennet và Lancette, 1998). Mười khuẩn lạc được tuyển chọn từ mỗi mẫu và chuyển đến từng ống nghiệm chứa môi trường TSB agar (như dung dịch gốc). Một loạt các thử nghiệm sau đó gồm : nhuộm Gram, catalase, coagulase, lên men kỵ khí của glucose và manitol, phân hủy đĩa thạch máu, sản xuất acetoin, methyl bred, vosges- proskauer, urase test, DNase, TNase (Bennet và Lancette, 1998).
Phát hiện độc tố Staphylococcal enterotoxins :
+ Sự có mặt của Staphylococcal enterotoxins (A, B,C, D, E) được xác định bởi phương pháp Sanwich ELISA với bộ kit enterotoxins staphylococcal (RIDASCREEN ®
set A, B, C, D, E ; R-Biopharm AG, Darmstadt, Đức).
Trong thực phẩm các độc tố này được xác địnhgần như chính xác với bộ kit từ 0,2- 0,7ppb.
+ Nền tảng của sự nhạy cảm của RIDASCREEN ® set A, B, C, D, E dựa trên thí nghiệm di truyền miễn dịch ở giới hạn 0,1mg/ml. Kết quả và các bước thử nghiệm được hướng dẫn phía sau lời hướng dẫn của bộ kit của nhà sản xuất.
+ Cho 15ml đệm PSB (pH7.4) được cho vào 10g mẫu, lắc trong 15 phút để hòa lẫn chúng với nhau. Sau khi lắc đem ly tâm 3500 vòng/10 phút ở 150C.
+ Thu dịch nổi bằng màng lọc (0,2µm), (SM 16534, Sartorius, Minisart), để loại những mảnh vụn của thực phẩm ra. Sau đó cho 100µl dịch lọc vào các giếng từ A-G (từ giếng A-E được phủ với kháng thể đặc hiệu chống lại Staphylococcal enterotoxins, giếng từ F-G được kiểm tra và phủ với kháng thể không miễn dịch của động vật).100µl mẫu đối chứng dương tính được đưa vào giếng H. Sự hiện diện của độc tố bị giữ lại bởi các KT đặc hiệu. Đĩa được lắc bằng tay một cách nhẹ nhàng và giữ ở nhiệt độ phòng trong 1h. Sau đó các giếng được rửa lại 3 lần, mỗi lần với 250µl đệm rửa cho mỗi giếng. Thêm
100 µl enzyme liên kết vào các giếng rồi lắc nhẹ nhàng, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1h. Rồi rửa l lại 3 lần với 250 µl đệm rửa. Thêm 50 µl chất nền và 50 µl chất tạo màu vào. Hòa trộn các đĩa nhẹ nhàng, ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Cuối cùng thêm 50 µl thuốc dừng vào mỗi giếng rồi lắc nhẹ nhàng. Sử dụng máy đo mật độ quang ở bước sóng 450nm vớivi đĩa đọc ( ELX 800, Universal Microplate Reader, BIO – TEK).
Phân tích thống kê:
Kết quả phân tích sử dụng phần mềm thống kê Minitab 15 ( Minitab version 15.1.0.0,2006) với các mô tả thống kê.
Kết quả :
+ Sự có mặt của các VSV được phân lập từ các mẫu pho mát và kem (log10cuf/g) được cho trong bảng 1 và 2.
Bảng 1 : The bacteria isolated from cheese samples. Number of bacteria (log 10 cfu/g).
Bacteria N n % Min Max Median SE Total aerobic mesophilic bacteria 50 50 100 6.30 10.8 8.21 0.19 Micrococcus/ Staphylococcus( CPS và CNS) 50 28 56 2.48 8.7 6.21 0.30 S.aureus 50 18 36 3.11 8.18 5.80 0.37
CPS: Coagulase Positive Staphylococcus; CNS: Coagulase negative Staphylococcus; N: Number of cheese samples; n:Number of positive
cheese samples; SE: Standart error.
Bảng 2: The bacteria isolated from ice cream samples. Number of bacteria (log 10 cfu/g).
Bacteria N n % Min Max Median SE Total aerobic mesophilic bacteria 50 48 96 2.30 7.64 4.29 0.12 Micrococcus/ Staphylococcus( CPS và CNS) 50 19 38 2.0 3.78 3.02 0.12 S.aureus 50 7 14 1.30 5.50 3.0 0.50
CPS: Coagulase Positive Staphylococcus; CNS: Coagulase negative Staphylococcus; N: Number of ice cream samples; n:Number of positive ice
cream Samples; SE: Standart error.
+ Kiểm tra 50 mẫu pho mát có 3 mẫu (6%) được xác định là có độc tố
Staphylococcal enterotoxins. Sự phân loại S. aureus và sự sản sinh enterotoxin của nó được phân lập từ các mẫu phop mát được cho trong bảng 3
Bảng 3: The count and enterotoxin type of S. aureus isolated from cheese samples. No. of cheese samples Count of S. aureus (cfu/g) Type of Staphylococcal
enterotoxin
28 2.6x105 B
32 5.5x107 C
48 8.0x105 E